王芳權(quán) 范方軍 夏士健 宗壽余 鄭天清 王 軍 李文奇許 揚(yáng) 陳智慧 蔣彥婕 陶亞軍 仲維功 楊 杰,*

水稻光溫敏核不育基因與的互作效應(yīng)

王芳權(quán)1,2范方軍1,2夏士健1宗壽余1鄭天清3王 軍1,2李文奇1,2許 揚(yáng)1,2陳智慧1,2蔣彥婕1,2陶亞軍1,2仲維功1,2楊 杰1,2,*

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 / 國(guó)家水稻改良中心南京分中心 / 江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心, 江蘇南京 210014;2揚(yáng)州大學(xué)江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚(yáng)州 225009;3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

與是水稻的光溫敏核不育基因, 其功能位點(diǎn)已經(jīng)明確, 然而它們?cè)趦上挡挥抵械男?yīng)尚不清楚。本研究針對(duì)與基因功能位點(diǎn), 分別設(shè)計(jì)了功能標(biāo)記AS-TMS5和CAPS-PMS3。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn), 這2個(gè)功能標(biāo)記能準(zhǔn)確區(qū)分不育、可育性狀對(duì)應(yīng)的隱性純合、雜合和顯性純合3種基因型。利用AS-TMS5和CAPS-PMS3對(duì)培矮64S/9311、廣占63S/湘恢47和粵光S/寧恢108的F2群體單株的基因型及育性的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),基因是廣占63S和粵光S控制光溫敏不育性狀的主效基因, 而基因在培矮64S和粵光S中并不能獨(dú)立起作用, 還需要與其他基因共同調(diào)控。進(jìn)一步分析粵光S/寧恢108的F2:3群體基因型與育性的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)在粵光S/寧恢108背景下, 攜帶基因的株系幾乎都表現(xiàn)可育, 而攜帶基因的株系在較高氣溫條件下表現(xiàn)不育, 但育性轉(zhuǎn)換溫度可能較高; 而攜帶與基因的株系育性轉(zhuǎn)換溫度比僅攜帶基因的株系低, 這為聚合2個(gè)基因選育不育性狀穩(wěn)定的光溫敏不育系提供了思路和方法。

;; 功能標(biāo)記; 光敏不育; 溫敏不育

1973年石明松在粳稻品種農(nóng)墾58中發(fā)現(xiàn)了一株不育的水稻材料, 后來(lái)證明該不育單株是由細(xì)胞核不育基因控制的, 其育性受光照時(shí)間調(diào)控, 在此基礎(chǔ)上提出了兩系法育種的新途徑[1]。兩系法育種靈活地利用了核不育系的育性轉(zhuǎn)換特點(diǎn), 具有不育性遺傳穩(wěn)定、遺傳行為簡(jiǎn)單、恢復(fù)源廣等諸多優(yōu)勢(shì), 使得兩系不育系成為我國(guó)水稻育種及生產(chǎn)中不可或缺的類(lèi)型, 在全國(guó)范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用[2]。但兩系核不育系的育性容易受光溫條件波動(dòng)的影響, 給不育系的繁殖和雜交種的制種造成了很多困難。2009年江蘇、四川、安徽等地的持續(xù)低溫使不育系育性波動(dòng), 給制種造成巨大損失[3]。因此, 針對(duì)兩系不育系育性穩(wěn)定性問(wèn)題, 很多研究者對(duì)育性轉(zhuǎn)換條件及不育的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究[4-7]。目前, 已經(jīng)定位了光敏不育基因[8-9]、[10]、()[11-12]和[13], 溫敏不育基因[14]、[15-16]、[17]、[18]、[19-20]、[21]和[22], 其中和基因已被克隆。

基因?yàn)闇孛舨挥? 該基因編碼一個(gè)核酸內(nèi)切酶——RNase ZS1, 該酶能夠把UbL40的mRNA降解為短片段[23]。在溫敏不育系安農(nóng)S-1的編碼區(qū)第71位堿基C突變?yōu)锳, 形成終止密碼子, RNase ZS1失活。氣溫高于23.5℃時(shí), UbL40基因表達(dá)上調(diào), 安農(nóng)S-1、株1S等品種由于RNase ZS1功能缺失, 花粉母細(xì)胞中UbL40大量積累, 花粉母細(xì)胞液泡化, 最終導(dǎo)致雄性不育。目前普遍使用的光溫敏不育系大多數(shù)由安農(nóng)S-1衍生而來(lái), 攜帶不育基因[23-25]?；騺?lái)源于農(nóng)墾58S, 轉(zhuǎn)錄一個(gè)1236 bp的長(zhǎng)鏈非編碼RNA——LDMAR, 在第789位點(diǎn)上存在一個(gè)C到G的變異, 影響LDMAR加工而來(lái)的小RNA與靶序列的結(jié)合, 導(dǎo)致花粉不育[26-27]。研究表明, LDMAR的表達(dá)還受到DNA甲基化調(diào)控。在長(zhǎng)日照情況下, LDMAR上游轉(zhuǎn)錄本AK111270產(chǎn)生的siRNA介導(dǎo)了LDMAR啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化, 引起雄性不育[28]。

在實(shí)際應(yīng)用中, 以和基因?yàn)楸尘暗牟挥诞a(chǎn)生的雜交稻占據(jù)了兩系雜交水稻的幾乎所有市場(chǎng)。近年來(lái), 以攜帶基因的Y58S、C815S配置的Y兩優(yōu)和C兩優(yōu)系列組合迅速增加, 至2012年以基因?yàn)橹鲗?dǎo)的雜交稻已經(jīng)占據(jù)兩系雜交水稻的95%以上[24,29]。可見(jiàn), 對(duì)于和基因及它們?cè)趦上挡挥抵械膽?yīng)用研究具有非常重要的意義。本研究利用和基因功能位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記, 分析了光溫敏不育系與常規(guī)水稻雜交F2和F2:3家系單株基因型與育性的關(guān)系, 以期為和基因在光溫敏不育系選育的應(yīng)用中提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試水稻材料有常規(guī)水稻品種5份, 包括日本晴、9311、南京16號(hào)、湘恢47和寧恢108; 主流兩系不育系品種或品系19份, 包括農(nóng)墾58S、安農(nóng)S-1、株1S、培矮64S、廣占63S、粵光S、N111S、C815S、Y58S、509S、武香S、深08S、1206S、1208S、L126S、L128S、豐39S、1892S和L816S。其中, 粵光S由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李傳國(guó)研究員以超級(jí)97/明七596雜交后代選育而成, 為溫度敏感性雄性核不育系水稻種質(zhì), 1206S、1208S為粵光S的衍生系。

培矮64S/9311、廣占63S/湘恢47和粵光S/寧恢108的F2群體, 以及粵光S/寧恢108的F2:3家系, 用于分析或基因型與育性的關(guān)系。2015年正季在南京的3個(gè)F2群體播種時(shí)間為5月20日。灌漿結(jié)實(shí)后, 選取抽穗期不遲于9月10日的單株, 調(diào)查結(jié)實(shí)率, 取葉片提取DNA, 用于檢測(cè)或基因型。

1.2 tms5、pms3基因功能標(biāo)記設(shè)計(jì)

已克隆水稻光溫敏基因, 且明確其功能位點(diǎn)[23]。安農(nóng)S-1攜帶的水稻溫敏不育基因在編碼區(qū)71位堿基C突變?yōu)锳, 形成TAG終止密碼子。參照日本晴和9311基因組序列, 安農(nóng)S在編碼氨基酸的70位堿基也發(fā)生了變異, 由G突變成了T, 因此本研究根據(jù)該位點(diǎn)的突變特點(diǎn), 利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)等位基因特異PCR (allele-specific PCR, AS-PCR)標(biāo)記, 命名為AS-TMS5 (表1)。純合基因型(,)只能被T5n-F/T5-R引物組合有效擴(kuò)增,純合基因型(,)只能被T5m-F/T5-R引物組合有效擴(kuò)增, 而雜合基因型()能同時(shí)被T5n-F/T5-R引物組合和T5m-F/ T5-R引物組合有效擴(kuò)增。理論擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為302 bp。

光溫敏不育基因?qū)儆陂L(zhǎng)鏈的非編碼RNA調(diào)控基因, 在789位點(diǎn)由C到G的變異引起了其功能喪失, 導(dǎo)致雄性不育[26-27]。該位點(diǎn)由C到G的變異使基因能夠被6 I (G/TAC)識(shí)別并切割。利用Oligo 7.0跨越該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了基因特異性功能標(biāo)記CAPS-PMS3 (表1)。CAPS-PMS3標(biāo)記能將待測(cè)水稻材料擴(kuò)增出410 bp片段,純合基因型(,)水稻材料的擴(kuò)增產(chǎn)物不能被6 I酶切開(kāi),純合基因型(,)水稻材料的擴(kuò)增產(chǎn)物能被6 I徹底酶切為280 bp和130 bp片段, 而雜合基因型()水稻材料的擴(kuò)增產(chǎn)物被6 I酶切后, 存在410、280和130 bp這3種帶型。引物序列見(jiàn)表1。

表1 TMS5、PMS3功能標(biāo)記引物

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及酶切

用CTAB法提取水稻基因組DNA。以DNA為模板, 以下列體系進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系包括: 10×PCR緩沖液(含20 mmol L–1Mg2+) 2 μL, dNTP (含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2 mmol L–1) 2 μL, 上、下游引物(各2 μmol L–1) 2 μL,酶0.5 μL, DNA 2 μL, 用滅菌ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 63℃或60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min, 結(jié)束反應(yīng)。其中, AS-TMS5標(biāo)記的退火溫度為63℃, CAPS-PMS3標(biāo)記的退火溫度為60℃。CAPS-PMS3標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物用6 I (NEB)酶切, 酶切反應(yīng)體系含: 10×buffer B 2 μL, PCR產(chǎn)物10 μL,6 I (10 U μL–1) 1 μL, 用滅菌ddH2O補(bǔ)足至20 μL, 37℃反應(yīng)3 h。PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物分別在含有核酸染料(DuRed)的瓊脂糖凝膠中電泳分離, 用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 TMS5和PMS3突變位點(diǎn)的測(cè)序驗(yàn)證

為了進(jìn)一步明確和基因突變位點(diǎn)信息, 用PCR方法擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的DNA片段并測(cè)序。針對(duì)基因突變位點(diǎn), 設(shè)計(jì)跨越該位點(diǎn)的測(cè)序引物TMS5-F: 5′-CCATCGTGCTTCGTGCC AAAA-3′和TMS5-R: 5′-TCGAGGGGGACGAGGTT GTG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR理論產(chǎn)物長(zhǎng)度約為475 bp。使用CAPS-PMS3標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)基因突變位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測(cè)序。

1.5 粵光S/寧恢108組合F2:3家系的獲得及育性分析

1.5.1 F2:3家系的獲得 2013年11月利用粵光S/寧恢108的F2群體種子在光照培養(yǎng)箱發(fā)芽長(zhǎng)成二葉一心的小苗, 提取DNA。用AS-TMS5和CAPS- PMS3標(biāo)記對(duì)100個(gè)粵光S/寧恢108 F2單株進(jìn)行檢測(cè), 選取基因型單株3株,基因型單株5株,基因型單株3株,基因型單株4株; 11月30日帶到海南三亞荔枝溝南繁基地加代, 2月底抽穗, 套袋自交, 各單株正常結(jié)實(shí), 按單株收獲F2:3種子。將2015年春季(4月)海南收獲的F2:3種子, 于2015年正季(5月), 在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田(南京)分兩期播種, 第1期于5月15日播種, 6月10日移栽; 第2期于6月1日播種, 6月25日移栽, 田間管理同常規(guī)大田。抽穗揚(yáng)花期對(duì)第1期播種的F2:3株系(S1~S15)進(jìn)行花藥形態(tài)、花粉染色分析, 從每個(gè)株系隨機(jī)選取3個(gè)單株。

1.5.2 花藥形態(tài)觀察 用鑷子將穎殼小心撥開(kāi), 去除外稃, 將花藥從內(nèi)稃中小心撥出, 于體視顯微鏡(KEYENCE DIGITAL MICROSCOPE VHX-500F)下觀察并照相記錄。

1.5.3 花粉育性檢測(cè) 將花藥置載玻片上, 用蓋玻片壓片釋放出花藥, 然后用1% I2-KI溶液染色, 在顯微鏡(OLYMPUS BX51)下觀察并用照相機(jī)(OLYMPUS DIGITAL CAMERA C5050Z)照相記錄。

1.6 氣象資料

用氣溫儀記錄試驗(yàn)田8月1日至9月30日的氣溫, 8月1日至9月10日, 日均溫度都高于23.5℃, 但日最低溫度從8月9日開(kāi)始, 只有8月15至20日高于23.5℃(圖1)。日照時(shí)間見(jiàn)附圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的功能標(biāo)記分析及測(cè)序驗(yàn)證

利用AS-TMS5標(biāo)記分別對(duì)24份水稻品種或品系進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。用T5n引物對(duì)常規(guī)稻日本晴、9311、湘恢47、寧恢108和不育系農(nóng)墾58S、培矮64S能擴(kuò)增出產(chǎn)物, 而用T5m不能擴(kuò)增出產(chǎn)物, 說(shuō)明這6個(gè)品種均不攜帶溫敏不育基因型; 用T5m對(duì)安農(nóng)S-1、株1S、廣占63S、粵光S、N111S、C815S、Y58S、509S、武香S、深08S、1206S、1208S、L126S、L128S、豐39S、1892S和L816S能擴(kuò)增出302 bp產(chǎn)物, 而用T5n不能擴(kuò)增出產(chǎn)物, 表明這17個(gè)不育系都攜帶純合的基因。南京16號(hào)為常規(guī)秈稻品種, 與日本晴、9311相比, 其基因的70位堿基由G突變?yōu)門(mén) (圖3), 該材料以AS-TMS5標(biāo)記擴(kuò)增的結(jié)果與其他常規(guī)稻相同, 為純合基因型。以上部分結(jié)果與已報(bào)道的研究結(jié)果一致[24], 表明本研究開(kāi)發(fā)的AS-TMS5標(biāo)記能經(jīng)過(guò)兩次獨(dú)立PCR準(zhǔn)確鑒定可育基因型和不育基因型。

圖1 2015年8月至9月田間氣溫走勢(shì)圖

利用CAPS-PMS3標(biāo)記引物擴(kuò)增24份水稻品種或品系的基因組, 然后用限制性內(nèi)切酶6 I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切(圖2)。農(nóng)墾58S、培矮64S、粵光S、509S、1206S和1208S這6個(gè)材料攜帶基因, 而其他都不攜帶基因, 也與前人報(bào)道一致[24], 說(shuō)明本研究的CAPS-PMS3標(biāo)記能準(zhǔn)確鑒定與基因型。

圖2 水稻品種(系)的AS-TMS5和CAPS-PMS3標(biāo)記檢測(cè)

1~24分別為: 日本晴、9311、南京16號(hào)、湘恢47、寧恢108、農(nóng)墾58S、安農(nóng)S-1、株1S、培矮64S、廣占63S、粵光S、N111S、C815S、Y58S、509S、武香S、深08S、1206S、1208S、L126S、L128S、豐39S、1892S和L816S。

1–24 represent Nipponbare, 9311, Nanjing 16, Xianghui 47, Ninghui 108, Nongken 58S, Annong S-1, Zhu 1S, Pei’ai 64S, Guangzhan 63S, Yueguang S, N111S, C815S, Y58S, 509S, Wuxiang S, Shen 08S, 1206S, 1208S, L126S, L128S, Feng 39S, 1892S, and L816S.

綜合兩個(gè)標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果, 在24份材料中, 常規(guī)稻日本晴、9311、南京16號(hào)、湘恢47和寧恢108不攜帶不育基因; 安農(nóng)S-1、株1S、廣占63S、N111S、C815S、Y58S、武香S、深08S、L126S、L128S、豐39S、1892S和L816S只攜帶不育基因; 農(nóng)墾58S和培矮64S只攜帶基因; 而509S、粵光S及其2個(gè)衍生系(1206S和1208S)同時(shí)攜帶2個(gè)不育基因。

利用引物TMS5-F/TMS5-R和CAPS-PMS3對(duì)部分品種的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析(圖3和圖4), 進(jìn)一步驗(yàn)證了這些材料攜帶的基因型與標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果完全對(duì)應(yīng)。說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的2個(gè)標(biāo)記能準(zhǔn)確地鑒定和這2個(gè)基因的等位基因型。

圖3 TMS5基因突變位點(diǎn)的測(cè)序分析

(a)和(b)的差異位點(diǎn)位于基因編碼區(qū)之前, (c)為起始密碼子, (d)為功能突變位點(diǎn)。

The polymorphic sites present in (a) and (b) are before the CDS ofgene; (c) site represents the start coding site; (d) site is the functional mutant site.

圖4 PMS3基因突變位點(diǎn)的測(cè)序分析

2.2 3個(gè)0F2群體的育性及基因型分析

經(jīng)檢測(cè), 培矮64S只攜帶基因(基因型為), 廣占63S只攜帶基因(基因型為), 粵光S同時(shí)攜帶和兩個(gè)基因(基因型為), 9311、湘恢47和寧恢108都不攜帶和基因(基因型為)(圖2)。本研究利用培矮64S/9311、廣占63S/湘恢47和粵光S/寧恢108的F2群體, 在南京正季播種, 單苗移栽, 灌漿結(jié)實(shí)后調(diào)查群體的結(jié)實(shí)率。

用CAPS-PMS3標(biāo)記對(duì)培矮64S/9311的F2群體中的9個(gè)不育單株和53個(gè)可育單株檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 不育單株既有純合基因型也有雜合基因型, 而可育單株包含了、、這3種基因型(附表1)。從以上結(jié)果可以看出, 并非所有攜帶基因型的F2單株都表現(xiàn)雄性不育, 而有些基因型單株也表現(xiàn)雄性不育。推測(cè)培矮64S中還有其他基因如、或目前未發(fā)現(xiàn)的基因與互作。

雜交組合“廣占63S/湘恢47”的89個(gè)F2單株中, 60個(gè)可育, 29個(gè)不育, 其分離比例符合3﹕1 (c2=2.34,c20.05, 1=3.84)。用AS-TMS5標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 攜帶基因型的28個(gè)單株都表現(xiàn)為雄性不育, 而雜合基因型的單株都表現(xiàn)為可育; 除了17號(hào)單株外, 攜帶純合基因型的單株都表現(xiàn)為可育(附表2)?；蚺c“廣占63S/湘恢47”F2單株的育性幾乎共分離, 表明是控制廣占63S雄性不育的主效基因。

在南京正季種植, 粵光S表現(xiàn)不育, I2-KI染色鏡檢屬無(wú)花粉型, 寧恢108及其雜交種花粉染色正常。利用AS-TMS5標(biāo)記和CAPS-PMS3標(biāo)記檢測(cè), 粵光S為基因型; 寧恢108為基因型, 它們的雜交種F1為雜合基因型, 說(shuō)明兩個(gè)標(biāo)記都可以準(zhǔn)確區(qū)分3種基因型, 是共顯性分子標(biāo)記。79個(gè)F2單株中, 可育單株57株, 不育單株22株, 育性符合3﹕1的分離比例(c2=0.06,c20.05, 1=3.84)。利用分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn), 22個(gè)不育單株均攜帶純合基因型, 而這些不育單株包含了、和基因型這3種類(lèi)型; 57個(gè)可育單株是或兩種基因型, 57個(gè)可育單株中也同時(shí)攜帶基因的、和這3種基因型(表2和圖5)。

表2 粵光S/寧恢108 F2群體基因型與育性的關(guān)系

Yueguang S: 粵光S; Ninghui 108: 寧恢108。F1: 粵光S/寧恢108雜交種; +:或純合基因型; –:或純合基因型; *:或雜合基因型; F: 可育; S: 不育。

F1: hybrid of Yueguang S/Ninghui 108; +: homozygous genotypeor homozygous genotype; –: homozygous genotypeor homozygous genotype; *: heterozygous genotypeor; F: fertile; S: sterile.

圖5 以AS-TMS5和CAPS-PMS3標(biāo)記檢測(cè)粵光S/寧恢108 F2群體部分單株

P1: 粵光S; P2: 寧恢108; F1: 粵光S/寧恢108雜交種; 1~45: 粵光S/寧恢108 F2群體部分單株。

P1: Yueguang S; P2: Ninghui 108; F1: hybrid of Yueguang S/Ninghui 108; 1–45: part of Yueguang S/Ninghui 108 F2population.

綜合3個(gè)F2群體單株的育性和基因型檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),基因不與雄性不育性狀共分離, 而基因與不育性狀共分離。在攜帶基因的2個(gè)F2群體中, 可育單株與不育單株符合3﹕1的分離比例, 說(shuō)明基因是控制溫敏不育的主效基因。

2.3 粵光S/寧恢108+組合F2:3家系育性與基因型分析

為了探討基因和基因是否存在互作關(guān)系, 進(jìn)一步研究了粵光S/寧恢108組合F2:3家系4種基因型的育性情況。分兩期播種F2:3家系, 第2期比第1期抽穗期大概遲約15 d (表3), 第2期花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)的日平均溫和最低溫都顯著低于第1期(圖1)。

通過(guò)對(duì)F2:3家系(第1期)的花藥形態(tài)、花粉染色和穗結(jié)實(shí)情況分析發(fā)現(xiàn), 與父本寧恢108相似,基因型的3個(gè)株系和的4個(gè)株系(S8株系的1個(gè)單株除外)都表現(xiàn)可育, 其花藥飽滿、充滿花粉, 花粉粒圓、染色深, 穗結(jié)實(shí)正常(表3和圖6), 表明基因不是兩系不育系粵光S的主效基因。而和基因型的株系則與母本粵光S相似, 表現(xiàn)不育, 其花藥細(xì)窄, 幾乎無(wú)花粉粒, 少量花粉粒畸形且不著色, 穗不結(jié)實(shí)。

表3 粵光S/寧恢108組合F2:3株系育性分析

圖6 粵光S/寧恢108組合F2:3株系育性分析

A: 花藥形態(tài)和花粉育性分析, 大圖標(biāo)尺為1 mm, 小圖標(biāo)尺為100 μm; B: 小穗結(jié)實(shí)分析, 標(biāo)尺為2 cm。

A: the anther morphology and pollen fertility; white bar, 1 mm; black bar, 100 μm; B: the fertility of panicle; bar, 2 cm.

對(duì)F2:3家系(第2期)的結(jié)實(shí)情況分析發(fā)現(xiàn),和基因型的所有單株(S1~S8)都表現(xiàn)可育;基因型株系(S9-S11)約59%的單株都可育, 與第1期相比, 可育單株數(shù)顯著增加, 可能與后期氣溫下降及光照時(shí)間縮短有關(guān)。而基因型株系(S12~S15)中, 除S12中的1個(gè)單株外, 所有單株都表現(xiàn)不育, 表明基因型株系比基因型株系的育性更不易受后期氣溫降低及光照時(shí)間縮短的影響。

結(jié)合兩期育性情況的結(jié)果可以看出, 在粵光S/寧恢108遺傳背景下,基因是調(diào)控育性的主效基因, 對(duì)植株的育性起決定作用;基因可能是調(diào)控育性的微效基因, 能增強(qiáng)基因背景下植株不育性狀的穩(wěn)定性; 推測(cè)基因和基因之間可能存在著直接或間接的互作關(guān)系。

2.4 粵光S/寧恢108后代ttpp基因型株系的育性表現(xiàn)

明確粵光S/寧恢108的F2:3株系部分植株不結(jié)實(shí)后, 對(duì)表3中株系S12 (基因型)的3個(gè)單株、株系S13 (基因型)的2個(gè)單株和株系S14 (基因型)的1個(gè)單株去穗留稻樁, 讓植株再生, 2次孕穗。由于溫度降低, 花粉恢復(fù)育性, 套袋自交, 收取種子, 帶海南加代繁殖, 后代按單株收種, 每個(gè)系各收取5個(gè)單株。2016年南京正季種F5代, 分兩期播種, 第1期于5月10日, 第2期于5月23日, 每個(gè)株系種35株苗。抽穗時(shí)間第1期在8月4日至8月22日之間, 第2期在8月13日至9月2日之間。觀察單株結(jié)實(shí)情況發(fā)現(xiàn), 選育的30個(gè)株系的所有單株均表現(xiàn)雄性不育, 表明通過(guò)標(biāo)記選擇聚合、基因, 能夠選育出育性更穩(wěn)定的不育系。

3 討論

兩系雜交水稻是我國(guó)南方稻區(qū)的主要水稻類(lèi)型,對(duì)國(guó)家糧食安全起著重要作用。近年來(lái), 兩系雜交稻的推廣面積逐年增加[30]。兩系不育系是培育優(yōu)良兩系雜交水稻的關(guān)鍵。然而, 目前兩系不育系的選育通常是在田間自然條件下鑒定, 選育過(guò)程容易受環(huán)境條件的直接影響, 工作量大且周期長(zhǎng), 育種效率低; 利用人工氣候房選育能夠獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果, 但工作量大, 成本很高。和基因的克隆和功能的明確為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇培育兩系不育系提供了可能。本研究根據(jù)和基因功能突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了等位基因特異PCR標(biāo)記AS-TMS5和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記CAPS-PMS3。與前人報(bào)道類(lèi)似[31-33], 本研究開(kāi)發(fā)的2個(gè)標(biāo)記能夠準(zhǔn)確且高效地區(qū)分兩個(gè)基因的可育和不育基因型, 可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。利用分子標(biāo)記輔助選擇和基因, 輔以田間或人工氣候房選育, 能夠大大縮短兩系不育系選育周期, 較準(zhǔn)確獲得不育起點(diǎn)溫度低、育性穩(wěn)定的光溫敏不育系。

水稻兩系不育系的光溫調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜, 很多不育系的育性轉(zhuǎn)換都是光溫效應(yīng)連動(dòng)的結(jié)果[34]。農(nóng)墾58S的育性主要受光照時(shí)間調(diào)控, 而農(nóng)墾58S的衍生不育系培矮64S則受溫度和光照的共同影響[27]。光溫敏雄性不育受主效不育基因和發(fā)育感溫、感光基因的共同調(diào)控, 而眾多微效不育基因影響育性轉(zhuǎn)換的條件。在本研究中, 廣占63S/湘恢47組合的F2單株中, 凡是攜帶基因的單株都表現(xiàn)不育, 表明基因是水稻光溫敏不育的主效基因。基因編碼一個(gè)核糖核酸酶RNase ZS1, 其轉(zhuǎn)錄受轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH138調(diào)節(jié), 但和的表達(dá)均不受氣溫調(diào)控[23,35]?；蛲蛔儗?dǎo)致RNase ZS1失去活性, 不能降解泛素基因Ub的mRNA, 而Ub基因的表達(dá)受高溫誘導(dǎo)。在高溫條件下, UbL40蛋白過(guò)量積累, 導(dǎo)致雄性不育。因此, 廣占63S光溫敏不育性狀的遺傳符合基因?yàn)橹餍Щ?Ub基因?yàn)榘l(fā)育感溫、感光基因的調(diào)控機(jī)制。與基因調(diào)控育性的機(jī)制不同,基因則是通過(guò)小RNA的表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控農(nóng)墾58S的光溫敏不育。培矮64S/9311組合的F2單株中, 不育性狀不與基因共分離, 很多攜帶純合基因型的單株也表現(xiàn)為可育, 表明培矮64S中基因并不是獨(dú)立起作用的, 還需要與其他基因(如、或目前未發(fā)現(xiàn)的基因)共同調(diào)控。研究表明,基因還受到其上游轉(zhuǎn)錄本AK111270產(chǎn)生的siRNA介導(dǎo)的甲基化調(diào)控[28]。在農(nóng)墾58S品種中過(guò)表達(dá)AK111270下調(diào)了基因的表達(dá)并影響了水稻對(duì)光周期育性轉(zhuǎn)換的條件。因此, 花粉的育性除了與基因型有關(guān), 還與其表達(dá)量有一定關(guān)系。在不同遺傳背景下,基因的表達(dá)量可能不同, 從而引起了育性的分化。進(jìn)一步對(duì)粵光S/寧恢108 F2單株育性和基因型情況分析也發(fā)現(xiàn), F2單株的育性與攜帶基因完全共分離, 而與基因無(wú)直接關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn), 廣占63S/湘恢47組合中1個(gè)基因型為的F2單株及粵光S/寧恢108組合1個(gè)基因型為的F2:3家系單株均表現(xiàn)不育, 這些現(xiàn)象也暗示了水稻兩系不育系光溫調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。隨著兩系雜交稻的應(yīng)用和推廣,基因在兩系不育系中起著主要作用。直至2012年, 攜帶基因的雜交水稻組合已占兩系雜交稻的95%以上[24]。

水稻光溫敏兩系不育系不僅受日平均溫度的影響, 同時(shí)也受到低溫持續(xù)時(shí)間的影響。通過(guò)粵光S/寧恢108四種基因型組合的F2:3家系育性與基因型關(guān)系分析發(fā)現(xiàn), 雖然在9月10日前, 田間日平均氣溫都連續(xù)高于23.5℃, 但在8月21日之后, 田間日最低氣溫就持續(xù)低于23.5℃。持續(xù)低溫可能是引起只攜帶基因的部分株系可育的原因。彭海峰等[7]研究表明, 攜帶不育基因的秈S、N28S的育性更不易受外界持續(xù)低溫的影響, 而培矮64S、N9S和N2S則更容易受低溫影響。研究發(fā)現(xiàn), 利用基因編輯技術(shù)敲除基因, 能夠獲得水稻溫敏不育材料[36-39]。在粵光S/寧恢108選出的F2:3單株中, 同時(shí)攜帶和基因的株系比僅攜帶基因的株系更不易受持續(xù)低溫的影響(表3)。表明基因增加了基因背景下育性的穩(wěn)定性, 預(yù)示著和基因可能在信號(hào)通路上存在直接或間接的關(guān)系。在已審定的水稻兩系不育系品種中, 同時(shí)含有不育基因和的品種還比較少, 目前鑒定到的僅有N422S、廣湘S和雙8S等[22]。然而, 是否在不同遺傳背景下, 同時(shí)攜帶和基因的品種的育性都相對(duì)穩(wěn)定, 仍然需要更全面深入的研究。但可以預(yù)測(cè)的是, 通過(guò)聚合光溫敏不育基因, 對(duì)于選育不育起點(diǎn)溫度更低、育性更加穩(wěn)定的不育系是有利的。

4 結(jié)論

開(kāi)發(fā)了水稻光溫敏不育基因和的功能標(biāo)記, 分析了培矮64S/9311、廣占63S/湘恢47、粵光S/寧恢108這3個(gè)群體F2單株及粵光S/寧恢108的F2:3家系中和基因與育性的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)基因是水稻光溫敏不育系的主效基因, 而基因并不能獨(dú)立起作用, 還需要與其他基因共同調(diào)控; 推測(cè)和基因同時(shí)存在可能提高不育系育性的穩(wěn)定性。本研究為利用和基因培育起點(diǎn)溫度低且育性穩(wěn)定水稻兩系不育系提供了思路。

附表1 培矮64S/9311 F2群體基因型與育性的關(guān)系

(續(xù)附表1)

F1: 培矮64S/9311雜交種; +:基因型; –:基因型; *:基因型; F: 可育; S: 不育。培矮64S、9311、雜交種F1及所有的F2單株都為純合基因型。

F1: hybrid of Pei’ai 64S/9311; +: homozygous genotype; –: homozygous genotype; *: heterozygous genotype; F: fertile; S: sterile; Pei’ai 64S, 9311, hybrid and all F2population carry the homozygous genotype.

附表2 廣占63S/湘恢47 F2群體基因型與育性的關(guān)系

F1: 廣占63S/湘恢47雜交種; +:基因型; –:基因型; *:基因型; F: 可育; S: 不育。廣占63S、湘恢47、雜交種F1及所有的F2單株都為純合基因型。

F1: hybrid of Guangzhan 63S/Xianghui 47; +: homozygous genotype; –: homozygous genotype; *: heterozygous genotype; F: fertile; S: sterile; Guangzhan 63S, Xianghui 47, hybrid and all F2population carry the homozygous genotype.

附圖1 2015年8月至9月田間日照走勢(shì)圖

Supplementary fig. 1 Sunshine time of experimental plot in August and September of 2015

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Interactive effects of the photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile genesandin rice

WANG Fang-Quan1,2, FAN Fang-Jun1,2, XIA Shi-Jian1, ZONG Shou-Yu1, ZHENG Tian-Qing3, WANG Jun1,2, LI Wen-Qi1,2, XU Yang1,2, CHEN Zhi-Hui1,2, JIANG Yan-Jie1,2, TAO Ya-Jun1,2, ZHONG Wei-Gong1,2, and YANG Jie1,2,*

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement / Jiangsu High Quality Rice R&D Center, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2Jiangsu Co-innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Theandare two photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile genes, and their functional sites are clarified. However, the interactive effects ofandin two-line sterile lines are still unclear. In this study, the functional markers AS-TMS5 and CAPS-PMS3 were designed, according to the functional sites ofandrespectively. The three genotypes ofandwereaccurately distinguished by AS-TMS5 and CAPS-PMS3. The relationship of the phenotype and genotype in the F2population of Pei’ai 64S/9311, Guangzhan 63S/Xianghui 47 and Yueguang S/Ninghui 108 were analyzed respectively. Thewas the major gene in Guangzhan 63S and Yueguang S, whilewas a non-independent gene in Pei’ai 64S and Yueguang S. By the phenotype and genotype analysis of the F2:3population of Yueguang S/Ninghui 108, the plants carryingalmost were fertile, while the plants carryingshowed sterility, and had higher transition temperature. Furthermore, the sterility of the plants carryingandmight have lower transition temperature than those carrying. Pyramiding ofandprovides an efficient scheme to breed photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile lines, which have lower transition temperature and safer production.

;; functional marker; photoperiod-sensitive male sterility; thermo-sensitive male sterility

2019-07-08;

2019-09-26;

2019-10-14.

10.3724/SP.J.1006.2020.92036

楊杰, E-mail: yangjie168@aliyun.com, Tel: 025-84390320

E-mail: wfqjaas@163.com, Tel: 025-84390320

本研究由國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2018ZX08001-02B), 江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(BK20171326)和江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(BE2018388, BE2017368)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2018ZX08001-02B), the Jiangsu Province Natural Science Foundation (BK20171326), and the Jiangsu Province Key Research and Development Program (Modern Agriculture) (BE2018388, BE2017368).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20191014.1534.013.html