劉代鈴 謝俊鋒 何乾瑞 陳四維 胡 躍 周 佳 佘躍輝 劉衛(wèi)國 楊文鈺 武曉玲

凈作和套作下大豆貯藏蛋白11S、7S組分相對含量的QTL分析

劉代鈴 謝俊鋒 何乾瑞 陳四維 胡 躍 周 佳 佘躍輝 劉衛(wèi)國 楊文鈺*武曉玲*

四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 / 四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心, 四川成都 611130

大豆貯藏蛋白的7S組分和11S組分占蛋白質(zhì)總量的70%左右, 其含量直接與大豆種子的加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)及功能特性密切相關(guān)。目前, 在玉米-大豆帶狀套作模式下11S和7S組分的相對含量會如何變化尚不明確。本研究以南豆12和九月黃為親本所構(gòu)建的重組自交系(RILs)群體為材料, 結(jié)合已構(gòu)建的SNP高密度遺傳圖譜, 在不同環(huán)境(E1: 2017年仁壽; E2: 2017年雅安; E3: 2016年仁壽)的凈作及套作下, 對控制貯藏蛋白組分含量的相關(guān)性狀進行QTL分析。結(jié)果表明, 在不同的環(huán)境和種植方式下, 親本和RIL群體的大部分貯藏蛋白11S、7S組分相對含量差異顯著或極顯著; 檢測到10個相關(guān)QTL, 分布于9條染色體, 表型貢獻率為5.63%~9.68%。通過注釋信息, 在定位到的QTL區(qū)段中初步篩選出65個與貯藏蛋白質(zhì)含量相關(guān)的候選基因。上述結(jié)果為大豆品質(zhì)育種提供了理論參考。

大豆; 貯藏蛋白; 蔭蔽; QTL定位

大豆(L.)是重要的糧、油、飼兼用作物[1]。在我國大豆供給嚴重不足的局面下[2], 保障和提高我國食用大豆品質(zhì)已成為當務(wù)之急。大豆籽粒中含有約40%~50%的蛋白質(zhì), 其中7S組分和11S組分占大豆蛋白質(zhì)總量的70%左右, 二者的相對含量與大豆種子的加工品質(zhì)[3]、營養(yǎng)品質(zhì)[4]及功能特性[5]密切相關(guān)。

大豆貯藏蛋白質(zhì)含量是數(shù)量性狀, 借助分子標記技術(shù)進行QTL定位分析是研究數(shù)量性狀的常用方法。根據(jù)大豆數(shù)據(jù)庫(www.soybase.org), 目前已報道29個與貯藏蛋白7S、11S組分含量相關(guān)的QTL[6-7]。除此之外, 劉順湖等[8]以科豐1號×南農(nóng)1138-2構(gòu)建重組自交系群體為材料, 用復(fù)合區(qū)間作圖法、多區(qū)間作圖法和完備區(qū)間作圖法定位到28個與11S、7S組分含量相關(guān)的QTL。簡爽等[9]運用線性回歸的方法進行表型和標記的關(guān)聯(lián)分析, 2年均檢測到的且與蛋白11S、7S組分相關(guān)聯(lián)的SSR位點有14個。

根據(jù)羅慶明[10]、蔣濤等[11]、蔡凌等[12]對玉米-大豆帶狀套作中大豆蛋白質(zhì)含量的研究結(jié)果, 套作大豆貯藏蛋白的11S、7S組分相對含量會受到氣象因子不同程度的影響, 不同品質(zhì)類型的大豆品種在凈作和套作下受到的影響不同。因此, 可根據(jù)大豆在不同環(huán)境下的蛋白質(zhì)含量的表現(xiàn), 選擇適合用于套作的大豆品種。

為了明確大豆貯藏蛋白組分含量對帶狀套作的響應(yīng)及其遺傳機制, 本研究利用南豆12和九月黃所構(gòu)建的重組自交系群體(RILs), 對凈作和套作下控制貯藏蛋白11S、7S組分的相對含量的QTL進行定位, 并篩選出相關(guān)候選基因, 為進一步探究大豆蛋白質(zhì)遺傳機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由栽培大豆品種南豆12為母本、地方品種九月黃為父本雜交衍生而來的含有200個家系的RIL群體(F9~10)為材料。帶狀套作所用玉米品種為半緊湊型的正紅505。

1.2 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組設(shè)計, 分別于E1 (2017年仁壽)、E2 (2017年雅安)和E3 (2016年仁壽) 3個環(huán)境中進行凈作和套作種植。玉米在每年的4月6日播種、8月上旬收獲, 大豆在每年的6月17日播種。凈作大豆行長2.5 m, 行距0.5 m, 穴距0.1 m, 每穴留單株。帶狀套作采用2︰2寬窄行模式, 玉米行間距0.4 m, 玉米行與大豆行間距0.55 m, 套作大豆的行長、行距、穴距與凈作大豆相同, 玉米密度為60,000株 hm-2。重復(fù)2次, 管理同一般大田。

1.3 試驗方法

大豆貯藏蛋白的提取及電泳參照王顯生等[13]的方法。利用Bradford法[14]測定樣品蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE選用5%的濃縮膠和12%的分離膠, 蛋白質(zhì)上樣量為30 μg。膠片在電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R-250染色, 乙醇和冰乙酸脫色, 利用EPSON LA2400掃描儀掃描成像。

利用Quantity One v4.6.2軟件, 根據(jù)亞基條帶光密度占該泳道總光密度的百分率[14], 分別計算11S組分和7S組分及其各亞基的相對含量、11S組分與7S組分相對含量之和以及11S組分與7S組分相對含量之比(11S/7S)。在11S組分中, Acid亞基相對含量等于A1a、A1b、A2和A4亞基含量之和, Basic亞基相對含量等于B1a、B1b、B2、B3和B4亞基含量之和, A3、A5亞基含量單獨計算。結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。

1.4 QTL定位與候選基因篩選

利用SLAF-seq技術(shù), 采用HighMap軟件繪制了1張大豆遺傳連鎖圖譜, 包括6366個分布于20個連鎖群的SNP標記, 圖譜總長度為2818.67 cM, 兩標記之間的平均遺傳圖距為0.44 cM。結(jié)合該遺傳連鎖圖譜[15], 利用QTL IciMapping v4.1軟件的完備區(qū)間作圖法(ICIM), 以1000次隨機排列計算出LOD=3.2為閾值, 進行QTL定位。QTL的命名參照McCouch[16]的方法, 略有改動。例如,,指QTL,是性狀英文簡寫,即該QTL所在的染色體,即該QTL所在染色體上的位置。

根據(jù)簡化基因組測序結(jié)果, 將QTL兩端SNP標記的物理位置與大豆基因組數(shù)據(jù)庫的全部基因物理位置進行比對, 結(jié)合各種功能數(shù)據(jù)庫(NR、Swiss- Prot、GO、KOG、KEGG), 對QTL區(qū)段中的編碼基因進行功能注釋。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)。利用IBM SPSS Statistics 22對貯藏蛋白質(zhì)含量相關(guān)性狀進行正態(tài)性檢驗和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本的表型分析及方差分析

對親本的貯藏蛋白11S、7S組分及其各亞基的相對含量分析的結(jié)果如表1、圖1、圖2所示。南豆12在E1、E2、E3中分別有5個、2個、2個貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)性狀的表型在不同種植方式中的差異顯著或極顯著; 九月黃在E1、E2、E3中均分別有3個貯藏蛋白11S、7S組分相對含量相關(guān)性狀的表型在不同種植方式中差異顯著或極顯著。在E1凈作下, 南豆12和九月黃之間的10個貯藏蛋白11S、7S組分相對含量相關(guān)性狀的表型差異顯著或極顯著; 在套作下, 兩親本間的A5亞基相對含量差異顯著。在E2凈作下, 兩親本間11S/7S比值差異極顯著; 在套作下, 兩親本間11S組分含量、11S與7S含量之和、A3亞基含量差異顯著。在E3中, 兩親本間凈作下的11S組分含量、11S/7S比值、α'亞基含量以及套作下的11S/7S比值、β亞基含量、Acid亞基含量差異顯著或極顯著。

2.2 RIL群體的表型分析、方差分析及相關(guān)性分析

如表2、圖1、圖2所示, 各性狀的極差總體在E3條件下較高, E1條件次之。RIL群體的貯藏蛋白質(zhì)含量的偏度、峰度絕對值多數(shù)小于1且服從正態(tài)分布。表明貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)性狀分離符合數(shù)量性狀遺傳特點, 該群體可用于QTL定位。

表1 不同環(huán)境及種植方式下親本的貯藏蛋白11S、7S組分相對含量

M: 凈作; RI: 套作。用不同的大小寫字母分別表示同一親本的籽粒貯藏蛋白11S、7S組分相對含量在不同種植方式下的差異達到0.01和0.05的顯著水平。在相同環(huán)境的同一行中, 用**、*和NS分別表示親本之間差異極顯著(< 0.01)、顯著(< 0.05)和不顯著。E1、E2和E3分別代表2017年仁壽、2017年雅安和2016年仁壽3種環(huán)境條件。

M: monoculture; RI: relay intercropping. Values followed by different capital letters and small letters are significantly different at< 0.01 and 0.05 respectively between treatments. In certain environment, **, *, and NS denote significance at< 0.01,< 0.05, and no significance in the same row, respectively. E1, E2, and E3 respectively represent at Renshou in 2017, Ya’an in 2017, and Renshou in 2016.

圖1 大豆貯藏蛋白亞基的SDS-PAGE圖譜

1: 南豆12; 2: 九月黃; 3: 158號家系材料; 4: 104號家系材料?？s寫同表1。

1: Nandou 12; 2: Jiuyuehuang; 3: RIL158; 4: RIL104. Abbreviations are the same as those given in Table 1.

縮寫同表1。Abbreviations are the same as those given in Table 1.

表3顯示, 除11S組分與7S組分相對含量之和在不同種植方式下差異不顯著外, 其余性狀在三因素及三因素交互作用下的差異均顯著或極顯著。

在E1、E2、E3中, 各性狀在凈作和套作下的相關(guān)性基本一致(表4)。11S及其各亞基相對含量、11S/7S比值和7S及其各亞基相對含量之間基本呈顯著或極顯著負相關(guān); 7S與11S相對含量之和、11S/7S比值和11S及其各亞基相對含量之間基本呈顯著或極顯著正相關(guān)。

2.3 QTL分析

共檢測到10個控制大豆貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)的QTL (表5), 在凈作和套作下各檢測到5個, 分布于9條染色體, 解釋了5.63%~9.68%的表型變異。在E1定位到5個QTL, 分布于6號、10號、14號、18號、19號染色體, 除和外, 其余QTL加性效應(yīng)均為負, 增效等位基因來自親本南豆12; 在E2定位到3個QTL, 分布于1號、8號染色體, 除外, 其余QTL加性效應(yīng)為負; 在E3定位到2個QTL, 分布于4號、20號染色體。

2.4 候選基因的篩選

在控制貯藏蛋白11S、7S組分相對含量的QTL區(qū)段內(nèi)總共注釋到229個基因, 在凈作中有138個, 在套作中有91個。如表6所示, 與貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)的候選基因共有65個, 按GO注釋結(jié)果將其分為5組, 在凈作中有34個, 在套作中有31個。第一組有30個基因, 與植物激素(生長素、脫落酸、乙烯)調(diào)節(jié)相關(guān), 影響貯藏蛋白的合成與運輸。第二組是19個與氨基酸合成相關(guān)的基因。第三組是14個與蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)基因, 蛋白質(zhì)磷酸化會影響蛋白質(zhì)功能特性。第四組包含22個基因, 這些基因控制與蛋白質(zhì)合成和加工相關(guān)的細胞器(液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng))所涉及的生物過程。第五組含有19個與種子發(fā)育相關(guān)的基因。

表2 RIL群體貯藏蛋白11S、7S組分相對含量基本統(tǒng)計量分析

(續(xù)表2)

縮寫同表1。Abbreviations are the same as those given in Table 1.

表3 大豆貯藏蛋白11S、7S組分相對含量的方差分析

E: 環(huán)境; P: 種植方式; G: 基因型。E×P、E×G和P×G分別表示環(huán)境和種植方式之間的互作、環(huán)境和基因型之間的互作以及種植方式和基因型之間的互作, E×P×G表示環(huán)境、種植方式和基因型間的互作。**表示差異達到極顯著水平(< 0.01),*表示差異達到顯著水平(< 0.05)。

E: environment; P: planting pattern; G: genotype. E×P, E×G, and P×G represented the interaction between the environment and planting pattern, the interaction between the environment and genotype, and the interaction between the planting pattern and genotype, respectively. E×P×G represented the interaction among environment, planting pattern, and genotype.**denotes significance at< 0.01 and*denotes significance at< 0.05.

表5 貯藏蛋白11S、7S組分相對含量相關(guān)QTL

表示11S與7S組分相對含量之和;和分別表示α和β亞基的相對含量;表示11S組分酸性亞基的相對含量?？s寫同表1。

represents the sum of the relative content of glycinin and β-conglycinin;andrepresents the relative content of α subunit and β subunit, respectively;represents the relative content of acid subunits from 11S fraction.Abbreviations are the same as those given in Table 1.

表6 貯藏蛋白含量相關(guān)的候選基因分類

3 討論

11S的含硫氨基酸含量較7S高, 所以11S/7S比值是衡量大豆營養(yǎng)品質(zhì)的一個重要指標, 但環(huán)境因素對貯藏蛋白11S/7S比值影響的研究少見報道。RIL群體的11S/7S比值呈E2>E1>E3的趨勢, 且均在凈作下顯著高于套作。結(jié)合氣象資料分析(表7), 大豆苗期(6月中旬至6月下旬)和成熟期(10月上旬至10月中旬)的日均溫差呈E3>E2>E1的趨勢, 結(jié)合盧為國等[17]研究可知苗期和成熟期較低的日均溫差有利于11S/7S比值提高, 因此本研究的11S/7S比值與前人結(jié)論一致; 而在苗期的日均溫度為E3>E2>E1, 由于苗期較高的日均溫度利于11S/7S比值提高[17], 本研究的11S/7S比值與前人結(jié)論相反; 據(jù)此推測, RIL群體在凈作下的11S/7S比值較高的原因可能是苗期套作大豆行間溫度較凈作低, 不利于套作下11S/7S比值的提高。

表7 3個環(huán)境6月至10月氣象資料

該數(shù)據(jù)來源于中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)(http://data.cma.cn/)?？s寫同表1。

The data are from National Meteorological Information Center (http://data.cma.cn/). Abbreviations are the same as those given in Table 1.

通過對不同環(huán)境、不同種植方式下貯藏蛋白亞基相關(guān)性狀間相關(guān)性分析(表4), 表明7S相對含量與11S相對含量之間呈現(xiàn)“此消彼長”的關(guān)系, 這與前人研究結(jié)果中7S組分和11S組分之間存在含量補償機制相符[18-20]。因此, 通過調(diào)節(jié)11S/7S比值可降低7S相對含量, 進而達到改善大豆蛋白制品的加工和營養(yǎng)品質(zhì)的目的[21]。

在大豆數(shù)據(jù)庫(www.soybase.org)中, 與貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)的QTL主要分布于1號、4號、6號、10號、17號染色體; 劉順湖等[8]利用ICIM法定位到控制11S、7S組分含量的QTL主要分布于1號、2號、15號染色體; 本研究定位到的QTL主要分布于1號染色體, 且共有5個QTL分布于1號、4號、6號、10號染色體。與前人結(jié)果比較, 發(fā)現(xiàn)在1號染色體上的的物理區(qū)段(51,558,983~51,642,998 bp)與Ma等[7]定位到的QTL物理區(qū)段(49,734,098~54,121,486 bp)重合。本研究在E1、E2、E3的不同種植方式下沒有檢測到穩(wěn)定的QTL, 可能是因為蛋白質(zhì)含量相關(guān)性狀容易受環(huán)境因素的影響, 如E3和E2在苗期(6月中旬至6月下旬)及成熟期(10月上旬至10月中旬)的日平均溫度均有差異, 從而造成各環(huán)境下蛋白質(zhì)合成與積累的不同。

根據(jù)基因注釋以及擬南芥數(shù)據(jù)庫(www. arabidopsis.org)信息, 在與貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)性狀的65個候選基因中篩選出2個可能相關(guān)的候選基因。在擬南芥中的同源基因的產(chǎn)物為富半胱氨酸受體激酶, 是酪氨酸激酶的一種; 酪氨酸激酶在擬南芥種子中參與脫落酸的轉(zhuǎn)導[22], 高濃度的(3.8 μmol L–1)脫落酸會減少土豆所有器官中硝酸鹽還原酶的活性[23], 在轉(zhuǎn)基因小麥中過表達煙草硝酸鹽還原酶基因會使小麥籽粒蛋白質(zhì)含量增加[24]。在擬南芥中的同源基因編碼的谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(GGT2), 是目前唯一一種能在谷胱甘肽中裂解谷氨酸和半胱氨酸之間肽鍵的酶[25], 而谷胱甘肽會影響大豆種子貯藏蛋白質(zhì)亞基的積累[26]。

4 結(jié)論

在不同的環(huán)境和種植方式下, 親本與RIL群體的貯藏蛋白組分含量及比值差異顯著或極顯著。與貯藏蛋白11S、7S組分含量相關(guān)的10個QTL貢獻率為5.63%~9.68%, 主要分布于1號染色體, 增效等位基因多來自于南豆12。在QTL區(qū)段中篩選出65個與貯藏蛋白質(zhì)含量相關(guān)的候選基因。

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QTL analysis for relative contents of glycinin and β-conglycinin fractions from storage protein in soybean seeds under monoculture and relay intercropping

LIU Dai-Ling, XIE Jun-Feng, HE Qian-Rui, CHEN Si-Wei, HU Yue, ZHOU Jia, SHE Yue-Hui, LIU Wei-Guo, YANG Wen-Yu*, and WU Xiao-Ling*

College of Agronomy, Sichuan Agricultural University / Sichuan Engineering Research Center for Crop Strip Intercropping System, Chengdu 611130, Sichuan, China

The relative contents of glycinin and β-conglycinin from storage protein are closely related to the quality and function of soybean seeds. However, it is not clear whether or how glycinin and β-conglycinin contents change in maize-soybean strip intercropping system. The glycinin and β-conglycinin relative contents of the recombinant inbred lines (RILs) derived from the cross of ‘Nandou 12’ and ‘Jiuyuehuang’ were measured under different environments (E1: 2017, Renshou; E2: 2017, Ya’an; E3: 2016, Renshou) and planting patterns (M: monoculture; RI: relay intercropping), among which the differences were significant or extremely significant in parents and RILs. Based on a genetic linkage map with 6366 SNP markers, we detected ten QTLs for glycinin and β-conglycinin relative contents which were distributed in nine linkage groups with the phenotypic variation of 5.63%–9.68%. According to the soybean genomic information, 65candidate genes were screened in the region of above-mentioned QTLs. These results lay a theoretical foundation for soybean quality breeding.

Soybean (L.); storage protein; shade; QTL mapping

2019-05-20;

2019-09-26;

2019-10-09.

10.3724/SP.J.1006.2020.94076

武曉玲, E-mail: wulx@sicau.edu.cn; 楊文鈺, E-mail: mssiyangwy@sicau.edu.cn

E-mail: icyfish00@163.com

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0101500)和四川省科技廳育種攻關(guān)項目(2016NYZ0031)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101500) and the Crops Breeding Project in Sichuan Province (2016NYZ0031).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20191008.1718.004.html