楊 黎 張 毅

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心和腫瘤中心，鄭州 450052)

楊 黎，博士，副研究員，碩士生導師，國際留學生導師，河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才，留學美國芝加哥大學。擔任中國研究型醫(yī)院學會生物治療學專業(yè)委員會委員、中國抗癌協(xié)會腫瘤與微生態(tài)專業(yè)委員會委員、中國抗癌協(xié)會腫瘤代謝專業(yè)委員會免疫代謝學組全國委員、中華醫(yī)學會醫(yī)學細胞生物學分會第六屆委員會青委會委員等學術兼職。主持國家自然科學青年基金1項及省部級項目6項。共發(fā)表相關論文70余篇，其中以第一作者在Mol Cancer、J Hematol Oncol、J Immunother Cancer、Cancer Lett、Oncoimmunology等雜志發(fā)表SCI文章19篇。主要從事腫瘤微環(huán)境及腫瘤固有信號通路對腫瘤免疫的調(diào)控機制研究。

張 毅，博士，教授，博士生導師，河南省特聘教授，鄭州大學一附院生物細胞治療中心主任，河南省腫瘤免疫和生物治療重點實驗室主任，曾在歐美留學和工作10余年。擔任中國研究型醫(yī)院學會生物治療學專業(yè)委員會副主任委員、中國醫(yī)藥質(zhì)量管理協(xié)會細胞治療質(zhì)量控制與研究專業(yè)委員會副主任委員等學術兼職。承擔國家自然科學基金6項和國家重點研發(fā)計劃項目2項。在Nat Cell Biol、J Clin Invest、Mol Cancer、Cancer Res、Oncogene、Oncoimmunology、Nat Commun、Cancer Immunol Res等雜志發(fā)表SCI論文152篇。從事腫瘤免疫基礎研究和臨床應用三十余年，主要研究方向為腫瘤微環(huán)境調(diào)控免疫抑制作用的相關機制、影響T細胞分化和功能的分子機制、腫瘤免疫治療新策略(靶向?qū)嶓w瘤的 CAR-T、TCR-T細胞和新抗原臨床應用)的臨床試驗研究等。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展所依賴的土壤，由免疫細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞等共同組成，其中免疫細胞是主要成分，因此炎癥是腫瘤微環(huán)境的一個重要標志[1]。腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞與腫瘤細胞相互作用，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細胞，其通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境介導腫瘤進展[3,4]。

一般來講，單核/巨噬細胞可極化為M1型或M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞也稱為經(jīng)典激活的巨噬細胞，由IFN-γ等促炎性細胞因子和免疫刺激性細胞因子(如IL-12、IL-23)誘導而成，這些細胞因子參與Ⅰ型輔助性T(T helper 1,Th1)細胞反應。而TAMs被認為更類似于M2型巨噬細胞[5]，亦被稱為替代激活的巨噬細胞，由Th2細胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13)激活。TAMs在炎癥和癌癥的關系方面起著重要作用。隨著TAMs與惡性腫瘤之間的關系不斷被揭示，TAMs被認為是腫瘤潛在的治療靶點。因此，本文總結(jié)了TAMs的來源、極化、如何參與腫瘤進展，以及其作為腫瘤治療靶點的研究進展。

1 TAMs的來源

組織中的巨噬細胞最初被認為是來源于骨髓，然而，來自于原始卵黃囊前體的局部自我維持的肺泡和腹腔巨噬細胞、庫普弗細胞、表皮朗格漢斯細胞和腦小膠質(zhì)細胞被稱為組織駐留巨噬細胞。雖然有證據(jù)表明各類巨噬細胞可以在腫瘤中共存，但招募的巨噬細胞占TAMs的大多數(shù)。目前，還無法評估這些巨噬細胞在不同腫瘤不同進展階段中的各自作用，仍需要進一步研究。

骨髓來源的外周血單核細胞在腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞和腫瘤細胞分泌的趨化因子的作用下，被招募至腫瘤局部并進一步分化為TAMs。無論巨噬細胞來自卵黃囊還是骨髓，CSF1均是大多數(shù)巨噬細胞的主要調(diào)節(jié)因子和趨化因子[6]。CCL2與其受體CCR2的結(jié)合直接介導了單核細胞招募至原發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤中[7]。在異種移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)，VEGFA可以趨化單核細胞，并在IL-4作用下極化為TAMs。在人乳腺癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，CCL18與其受體PITPNM3結(jié)合，協(xié)同CSF2介導了巨噬細胞的招募[8]。在結(jié)腸癌模型中發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞的招募是通過CCL20結(jié)合其受體CCR6介導的，該趨化因子的缺失導致了單核細胞和/或TAMs的下調(diào)及腫瘤的消退[9]。CXCL12/CXCR4軸介導了TAMs的累積，并與B16惡性黑色素瘤的進展相關[10]。

2 TAMs的極化

在腫瘤微環(huán)境中TAMs一般表現(xiàn)為M2型巨噬細胞的特征，表達抗炎性細胞因子、清除受體、血管生成因子和蛋白酶的水平高于M1型巨噬細胞。這些抗炎性細胞因子可以重塑腫瘤免疫抑制微環(huán)境，進而促進腫瘤進展。TAMs的極化不受其所在部位本身影響，而是受到其所在特定微環(huán)境的信號作用所致。影響TAMs極化的因素包括腫瘤細胞來源的因子、腫瘤微環(huán)境、巨噬細胞自分泌因子及穩(wěn)態(tài)失衡因素。

2.1腫瘤細胞來源的因子 腫瘤細胞產(chǎn)生的多種因子可以促進巨噬細胞向M2型極化。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞來源的CSF1可促進巨噬細胞的招募和極化[11]。趨化因子CCL2、CCL3和CCL14刺激多發(fā)性骨髓瘤中巨噬細胞的增殖和極化[12]。IL-10抑制了巨噬細胞中促炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，導致巨噬細胞向M2型極化[13]。IL-4與CSF1協(xié)同作用，誘導M2型巨噬細胞極化[14]。最近的研究表明，腫瘤細胞來源的微顆粒介導了TAMs的極化，促進了腫瘤進展[15]。此外，前列腺癌細胞來源的Cathelicidin相關抗菌肽再教育巨噬細胞向M2型極化[16]。可溶性MHCⅠ類鏈相關分子通過激活STAT3信號通路誘導巨噬細胞向免疫抑制表型轉(zhuǎn)變[17]。

2.2腫瘤微環(huán)境 一旦外周血單核細胞被招募至腫瘤部位，腫瘤微環(huán)境則迅速促進其分化成TAMs。腫瘤微環(huán)境中的多種細胞分泌細胞因子調(diào)節(jié)巨噬細胞極化，包括CD4+細胞分泌的Th2型細胞因子IL-4[18]，調(diào)節(jié)性T細胞分泌的IL-10[19]，及B細胞分泌的免疫球蛋白[20]。Th2細胞來源的IL-13亦可能對TAMs極化發(fā)揮促進作用，因為IL-13和IL-4信號級聯(lián)重疊可導致STAT6激活，盡管體內(nèi)實驗尚未證實[21]。此外，間充質(zhì)基質(zhì)細胞來源的MFG-E8已被證實可增強巨噬細胞向M2型極化[22]。

2.3巨噬細胞自分泌因子 最近報道稱，巨噬細胞自身來源的MIF是黑色素瘤小鼠中TAMs極化的重要決定因素[23]。MIF缺失或應用MIF拮抗劑可以明顯減弱TAMs極化，并降低TAMs中促血管生成基因的表達。另外，腫瘤浸潤的巨噬細胞可產(chǎn)生IL-10促進自我極化[24]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞自分泌CXCL12調(diào)節(jié)自身向具有免疫抑制功能的方向分化[25]。

2.4穩(wěn)態(tài)失衡 低氧可以促進腫瘤進展及轉(zhuǎn)移，主要通過HIF介導，HIF亦可調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能[26]。HMGB1、細胞外ATP等與巨噬細胞表面Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)結(jié)合，導致巨噬細胞功能改變。研究還發(fā)現(xiàn)，TLR2和TLR6信號通路均能通過誘導巨噬細胞TNF-α的產(chǎn)生促進肺癌進展[27]。腫瘤細胞來源的細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)，包括二聚糖和透明質(zhì)酸，可以通過TLR2和TLR4信號通路促進TAMs極化[28]。至關重要的是，這些ECM成分在非炎癥組織中并不與TLRs結(jié)合，而是在蛋白酶裂解或與活性氧或氮相互作用后成為TLRs配體，從而形成檢測炎癥和組織破壞的感應通路。此外，在白血病干細胞微環(huán)境中TAMs亦可由骨髓來源的其他抑制細胞分化而來[29]。

3 TAMs調(diào)控腫瘤進展

TAMs在促進腫瘤進展中起著至關重要的作用，包括促進腫瘤發(fā)生和進展、形成免疫抑制微環(huán)境、促進轉(zhuǎn)移及建立癌前轉(zhuǎn)移微環(huán)境、促進腫瘤血管生成(圖1)。

3.1促進腫瘤發(fā)生和進展 TAMs聯(lián)系著炎癥和癌癥。2009年，癌癥相關的炎癥首次被定義為癌癥的標志之一。有證據(jù)表明，炎癥微環(huán)境促進了腫瘤上皮細胞和浸潤免疫細胞(如巨噬細胞)的基因不穩(wěn)定性。最近，TAMs來源的炎性細胞因子IL-23和IL-17被證明與癌癥進展密切相關[30]。Kupffer細胞可以通過分泌有絲分裂原促進肝細胞癌進展，該機制依賴于NF-κB信號通路[31]。另有數(shù)據(jù)表明，TAMs來源的IL-6通過STAT3信號通路促進肝癌的發(fā)生發(fā)展[32]，TAMs來源的IL-10通過STAT1信號通路促進非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[33]。這些結(jié)果揭示，腫瘤浸潤的巨噬細胞在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。

圖1 TAMs促進腫瘤進展的機制及其作為腫瘤治療靶點的策略Fig.1 TAMs promote tumor progression and clinical applic-ation of TAMs as a therapeutic target for cancer

3.2形成免疫抑制微環(huán)境 TAMs是腫瘤微環(huán)境中主要的免疫調(diào)節(jié)細胞，參與抑制細胞毒性T淋巴細胞的抗腫瘤效應。惡性胸腔積液中TAMs分泌TGF-β增多，導致T細胞抗腫瘤效應降低[34,35]。在小鼠腫瘤模型中，TAMs抑制CD8+T細胞的增殖，在一定程度上通過誘導iNOS或Arginase I產(chǎn)生ROS，導致免疫抑制作用[36]。TAMs產(chǎn)生的IL-10可誘導共刺激分子PD-L1在單核細胞中的表達，從而抑制細胞毒性T淋巴細胞抗腫瘤效應[37]。此外，TAMs來源的PGE2、IL-10、吲哚胺2,3-雙加氧酶在調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cells,Tregs)的誘導過程中發(fā)揮重要作用，TAMs來源的CCL17、CCL18、CCL22是Tregs的重要趨化因子，Tregs進一步抑制腫瘤微環(huán)境中T細胞的免疫效應作用[38]。

3.3促進轉(zhuǎn)移及建立癌前轉(zhuǎn)移微環(huán)境 TAMs促進腫瘤進展的機制還包括增強腫瘤轉(zhuǎn)移和建立轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[39]。在人移植瘤模型中研究發(fā)現(xiàn)，TAMs來源的CCL18促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[40]。腫瘤細胞通過ECM遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的，而TAMs被認為可以通過ECM促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[41]。TAMs可以產(chǎn)生蛋白酶，包括組織蛋白酶B、MMP2、MMP7和MMP9，并可裂解ECM，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供通道和途徑。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transit-ion,EMT)在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，闡明EMT的調(diào)控機制將大大提高我們對腫瘤遷移和侵襲的認識。越來越多的證據(jù)表明，EMT是TAMs與腫瘤細胞相互作用之后腫瘤變化的重要特征，TAMs來源的相關因子在EMT的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[42]。

根據(jù)動物模型的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAMs在腫瘤形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中起著關鍵作用。腫瘤組織中TAMs分泌的TNF-α、VEGF和TGF-β可以通過血流運輸?shù)桨衅鞴?，誘導局部巨噬細胞產(chǎn)生S100A8和血清淀粉樣蛋白A3，這些因子進一步招募巨噬細胞和腫瘤細胞進入靶器官中，促進轉(zhuǎn)移灶的形成[43]。因此，TAMs被認為不僅可以影響局部微環(huán)境，還會影響全身的巨噬細胞，從而導致腫瘤的進展。

3.4促進腫瘤血管生成 一些研究表明，TAMs水平與腫瘤中血管數(shù)量密切相關。低氧是腫瘤血管生成的主要驅(qū)動因素。腫瘤低氧區(qū)域，特別是壞死組織發(fā)現(xiàn)巨噬細胞大量聚集。巨噬細胞上HIF-1的表達調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，如調(diào)控VEGF在腫瘤缺氧部位的血管生成。基因分析結(jié)果顯示，TAMs可以產(chǎn)生VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-8 (CXCL8)、PDGF、bFGF、胸苷醛糖、MMPs和其他分子，參與腫瘤血管生成，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)[44]。在原位和轉(zhuǎn)基因腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，Tie2+TAMs與腫瘤血管系統(tǒng)密切相關，促進血管生成，且依賴于內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的血管生成素-2和沿血管系統(tǒng)分布的TAMs上Tie2受體的表達[45]。

4 TAMs作為腫瘤治療的靶點

如上所述，在不同的癌癥模型中TAMs促進腫瘤生長，TAMs數(shù)量的增加與多種腫瘤的不良預后密切相關。因此，靶向TAMs是一種新的癌癥治療策略，包括限制單核細胞招募、靶向TAMs活化、重編程TAMs為抗腫瘤活性及靶向TAMs與標準治療聯(lián)合應用四個方面(圖1)。

4.1限制單核細胞招募 靶向TAMs的策略之一是阻斷單核細胞向腫瘤組織趨化。由于CCL2/CCR2軸在單核細胞招募過程中起著重要作用，因此靶向該通路是非常有效的腫瘤治療方法。CCL2阻斷劑(carlumab,CNTO88)在動物模型中已被證明可以抑制多種腫瘤的生長。一項針對轉(zhuǎn)移性去勢難治性前列腺癌的Ⅱ期臨床試驗研究顯示，雖然carlumab抗體耐受性良好，但是單一應用該抗體既無法阻斷CCL2/CCR2軸，也沒有顯示抗腫瘤活性(NCT00992186)[46]。Brana等人的研究結(jié)果與之類似，carlumab聯(lián)合四種化療方案治療實體瘤，患者耐受性良好，但未觀察到血清中CCL2的下調(diào)及明顯的腫瘤消退反應(NCT01204996)。然而，其他研究結(jié)果表明，應用carlumab抗體患者耐受性良好，并出現(xiàn)短暫的CCL2抑制及初步的抗腫瘤活性反應(NCT00537368)[47]。

Sanford等人研究發(fā)現(xiàn)，CCR2拮抗劑(PF-04136309)可阻斷CCR2+單核細胞從骨髓向腫瘤部位募集，抑制胰腺癌生長和遠處轉(zhuǎn)移[48]。一項Ⅰb期臨床試驗研究應用PF-04136309聯(lián)合FOLFIRINOX化療方案治療腫瘤(NCT01413022)，結(jié)果顯示該療法安全且耐受性強，并具有一定的腫瘤客觀反應率[49]。此外，CCR2特異性人源化抗體(MLN1202)的有效性在臨床試驗研究中得到了證實(NCT01015560)。

CD11b中和單克隆抗體已被證明可以有效防止髓系細胞向腫瘤部位募集。已有研究表明，應用Mac-1(CD11b/CD18)抗體可以改善小鼠鱗狀細胞癌異種移植瘤的放療反應，并可減少表達MMP-9和S100A8髓系細胞的瘤內(nèi)浸潤[50]。

4.2靶向TAMs活化 使用不同策略靶向TAMs活化亦是有效的腫瘤治療方法。CSF1/CSF1R信號通路在骨髓單核細胞的產(chǎn)生和腫瘤組織中TAMs極化方面起著關鍵作用。因此，CSF1/CSF1R信號通路是一種具有廣闊前景的癌癥治療靶點。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，CSF1基因缺失可顯著降低乳腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌瘤的轉(zhuǎn)移及延緩腫瘤進展[51]?；谝陨辖Y(jié)果，多項應用CSF1/CSF1R抑制劑的臨床試驗研究已經(jīng)完成或正在進行。

巨噬細胞表面標志物可作為有效的治療靶點。甘露糖受體CD206可看作巨噬細胞特異性靶點。與CD206受體結(jié)合的單鏈肽被連接到納米載體上，選擇性靶向CD206+TAMs[52]。Legumain是一種應激蛋白，屬于天冬酰胺內(nèi)肽酶家族成員，其在TAMs中過表達，可作為一種有效的治療靶點[53]。利用免疫毒素結(jié)合的單克隆抗體靶向巨噬細胞表面標志物清道夫受體A和CD52，已在卵巢癌中進行了研究[54]。此外，alemtuzumab(抗CD52抗體)治療腫瘤的研究正在進行臨床試驗(NCT00637390,NCT00073879)。

Trabectedin(ET743,Yondelis)通過誘導單核巨噬細胞的凋亡來減少腫瘤組織中TAMs的數(shù)量[55,56]。目前，trabectedin已獲得歐盟委員會的上市批準，用于治療卵巢癌和軟組織肉瘤，并在2015年獲FDA批準用于治療不可切除的轉(zhuǎn)移性脂肪肉瘤或平滑肌肉瘤[57]。

4.3重編程TAMs為抗腫瘤活性 如前所述，巨噬細胞的關鍵特征之一是具有可塑性，這使得其能夠根據(jù)腫瘤微環(huán)境的不同改變表型。因此，將TAMs重編程為抗腫瘤表型是一種非常具有潛力的腫瘤治療策略?？鼓[瘤巨噬細胞(M1型)具有良好的清除和破壞腫瘤細胞的能力[58]。我們前期研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌在治療惡性胸腔積液過程中，可以將CD163+TAMs極化為M1型巨噬細胞，提示重編程CD163+TAMs可作為惡性胸腔積液潛在的治療策略[59]。

目前，納米顆粒逐漸被應用于極化TAMs為抗腫瘤表型的方法。Zanganeh等[60]發(fā)現(xiàn)納米氧化鐵(ferumoxytol)能顯著抑制小鼠皮下腺癌的生長，并伴有腫瘤組織中M1型巨噬細胞的增加。二氧化錳納米顆粒通過誘導TAMs極化為M1型巨噬細胞，從而增強化療反應[61]。負載IL-12的納米顆?？梢阅孓D(zhuǎn)巨噬細胞具備抗腫瘤功能[62]。

CD40是巨噬細胞表面標記物，CD40激動劑與吉西他濱聯(lián)合應用治療不可切除的胰腺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法通過增強抗腫瘤巨噬細胞的功能，促使腫瘤消退[63]。ChiLob7/4是嵌合CD40單克隆抗體，能夠誘導巨噬細胞促炎性細胞因子的產(chǎn)生，一項針對常規(guī)治療耐藥的表達CD40實體瘤和彌漫大B淋巴瘤的Ⅰ期臨床試驗研究結(jié)果顯示，該療法具有廣闊的應用前景[64](NCT01561911)。靶向CD40分子的其他臨床試驗研究目前正在進行中(NCT01103635)。

應用TLR激動劑、抗CD40抗體和IL-10抗體通過激活NF-κB信號通路，極化TAMs為抗腫瘤表型[65]。一種STAT3小分子抑制劑(WP1066)可以逆轉(zhuǎn)惡性腦膠質(zhì)瘤患者的免疫耐受，選擇性誘導共刺激分子CD80、CD86和IL-12在外周血和腫瘤浸潤的巨噬細胞上的表達，誘導巨噬細胞向抗腫瘤表型極化[66]。目前一項臨床試驗正在研究這種藥物治療復發(fā)性惡性腦膠質(zhì)瘤及轉(zhuǎn)移(NCT01904123)。

Thymosin-α是一種免疫調(diào)節(jié)激素，可以再教育TAMs為樹突狀細胞，產(chǎn)生高水平的促炎性細胞因子，參與抗腫瘤免疫反應。此外，一些臨床試驗研究已證實，Thymosin-α可以延長轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和進展期非小細胞肺癌患者的生存期[67]。

β-glucan是一種酵母來源的多聚糖，可以極化TAMs為M1型巨噬細胞，是一種強有力的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑[68]。在一項Ⅱ期臨床試驗研究中，應用β-glucan聚合物(PGG)顯示出適當?shù)目鼓[瘤活性[69](NCT00912327)。

4.4靶向TAMs與標準治療聯(lián)合應用 放療和化療是許多癌癥的有效治療方法。研究表明放療后腫瘤組織中髓系細胞浸潤增加。然而，放化療后腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的相互作用仍不明確。在動物模型中發(fā)現(xiàn)，放療后腫瘤DNA受損、細胞凋亡及缺氧增加，可導致巨噬細胞的招募及促進腫瘤進展[70]。更引人注目的是，阻斷CSF1R信號通路增強了其他幾種標準療法的療效，CSF1R的阻斷已被證明可提高化療對胰腺癌的療效[71]。因此，認為靶向TAMs治療與標準治療相結(jié)合是腫瘤有效的治療手段。

5 結(jié)語

本文就TAMs的起源、極化、功能及臨床應用方面進行了闡述。TAMs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用。因此，更好地了解TAMs在臨床上的應用，尤其是作為腫瘤治療的靶點將是至關重要的。靶向TAMs是一種很有前途的腫瘤治療策略。近期正在進行的關于TAMs的體內(nèi)外實驗、臨床前和臨床試驗研究均顯示了令人鼓舞的結(jié)果。我們相信，未來靶向TAMs將會應用于腫瘤患者的治療。