張英英 單海軍 郭 鑫

(河南省中醫(yī)院兒童腦病康復(fù)科,鄭州 450002)

新生兒缺氧缺血性腦病是指新生兒圍生期窒息引起的缺氧缺血性腦損傷，是新生兒不可逆性腦損傷和新生兒死亡的主要原因，輕者可引起患兒輕度癱瘓、學(xué)習(xí)障礙、注意力缺陷、細(xì)微運(yùn)動(dòng)問(wèn)題等，嚴(yán)重者可遺留癲癇、腦性癱瘓等難治性?xún)和X病，針刺在治療缺氧缺血性腦病中取得較好效果[1,2]，但其機(jī)制尚不十分清楚。缺氧缺血性腦病的病理生理過(guò)程比較復(fù)雜，可出現(xiàn)腦水腫、自由基產(chǎn)生、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、炎癥反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化等，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫細(xì)胞，在缺氧缺血腦損傷刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化[3]，釋放大量炎癥細(xì)胞因子，特別是IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，引起腦組織損傷[4,5]。本文就針刺對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥反應(yīng)的影響進(jìn)行研究，探討針刺治療缺氧缺血性腦病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7日齡、清潔級(jí)、新生、體重12～14 g、SD大鼠150只[購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SYXK(豫)2013-0024]。

1.1.2主要試劑 TTC(美國(guó)Sigma公司)，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam公司)，DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒、羊抗小鼠Iba-1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)等。

1.2方法

1.2.1分組及缺氧缺血性腦損傷模型建立 將150只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組和針刺組，每組50只。模型組和針刺組大鼠采用RICE法建立缺氧缺血性腦損傷模型：乙醚吸入麻醉成功后，在大鼠中位頸部切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，并進(jìn)行結(jié)扎，縫合傷口，2 h后，將大鼠置于密閉缺氧環(huán)境中，給予92%N2+8%O2混合氣體缺氧處理2.5 h。假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行血管結(jié)扎及缺氧處理。

1.2.2各組大鼠處理 建模后，假手術(shù)組和模型組大鼠不進(jìn)行針刺處理，針刺組大鼠進(jìn)行針刺處理：選擇“靳三針療法”中的“腦三針”“顳三針”“智三針”取穴，結(jié)合人與動(dòng)物的骨度比、參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行穴位定位。腦三針：從大鼠頸椎向上摸到枕骨粗隆上緣向上0.1寸為第1針，向兩旁摸到枕骨粗隆兩側(cè)緣定位第2針和第3針；顳三針：大鼠耳根上緣中點(diǎn)向上0.5寸為第1針，前后耳根向上與第1針?biāo)教幎ㄎ坏?針和第3針；智三針：從兩眼連線中點(diǎn)向上摸到額骨和頂骨之間的冠狀縫定位第1針，眼睛內(nèi)外眥連續(xù)外1/3向上0.3寸定位第2針和第3針。每個(gè)穴組先刺第1針，再刺第2針和第3針，“腦三針”和“顳三針”向下平刺，“智三針”向百會(huì)方向平刺，每個(gè)穴位得氣后行捻轉(zhuǎn)手法均勻、持續(xù)捻轉(zhuǎn)20 s，120次/min，不留針，每天1次，共7 d。

1.2.3取材 治療結(jié)束后，各組隨機(jī)取10只大鼠斷頭處死，取腦組織置于PBS液中冷卻，用于腦組織TTC染色；各組取10只大鼠，灌注固定后取腦組織，梯度脫水、透明、石蠟包埋，用于腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1表達(dá)測(cè)定；各組取10只大鼠，取大鼠腦組織放入液氮中保存，用于ELISA和RT-PCR檢測(cè)；各組取10只大鼠用于空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定。各組剩余大鼠用于其他實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4腦梗死情況測(cè)定 將PBS液中腦組織沿冠狀面切片，厚度2 mm，5片。采用TTC染色法對(duì)腦組織進(jìn)行染色，將腦組織切片浸入TTC溶液中孵育30 min，PBS液沖洗，福爾馬林溶液中固定，染色固定后梗死區(qū)域腦組織呈白色，正常腦組織呈紅色，采用Image J 1.8.0軟件測(cè)量腦梗死面積，計(jì)算腦梗死面積占同側(cè)腦組織總面積百分比。

1.2.5腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1表達(dá)測(cè)定 采用免疫組化法測(cè)定腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1表達(dá)情況：腦組織石蠟包塊切成厚5 μm切片，室溫復(fù)溫15 min，烘烤30 min，脫蠟至水，滴加山羊血清孵育20 min，加入Iba-1抗體過(guò)夜孵育，滴加聚合物輔助劑孵育20 min，滴加二抗孵育20 min，DAB顯色，染核、脫水、封片后，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，每張切片選5個(gè)400倍高倍視野計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平測(cè)定 每只大鼠取50 mg腦組織，加入Trizol孵育5 min，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量Real-time PCR 檢測(cè)測(cè)定腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 15 s、62℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量以IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)量與β-actin表達(dá)量的比值表示。

1.2.7腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平測(cè)定 每只大鼠取50 g腦組織加入勻漿液勻漿后，離心(12 500 r/min)25 min，取上清液，采用ELISA法測(cè)定腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平(具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。

1.2.8大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 治療結(jié)束后14 d(大鼠28 d齡)時(shí)，每組取10只大鼠，采用Morris水迷宮測(cè)定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。第1天至第5天對(duì)大鼠進(jìn)行平臺(tái)訓(xùn)練，將直降14 cm、高32 cm平臺(tái)置于迷宮中水下1 cm處，從4個(gè)不同方向隨機(jī)分4次放入迷宮中，自由探索直到找到平臺(tái)，其到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，2 min內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)者被引導(dǎo)至平臺(tái)并停留15 s，記錄逃避潛伏期為2 min，記錄各組大鼠第5天的逃避潛伏期進(jìn)行比較。第6d進(jìn)行空間搜索，從迷宮中將平臺(tái)移除，從平臺(tái)相對(duì)應(yīng)的位置將大鼠放入迷宮，測(cè)試2 min，觀察大鼠穿過(guò)平臺(tái)位置的次數(shù)，將其作為大鼠穿臺(tái)指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)，穿臺(tái)指數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿臺(tái)指數(shù)增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠腦梗死面積比較 假手術(shù)組大鼠腦組織均呈紅色，無(wú)梗死現(xiàn)象；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)大片明顯的白色梗死區(qū)域；針刺組大鼠腦組織出現(xiàn)小部分白色梗死區(qū)域。針刺組腦梗死面積明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

2.3各組大鼠腦組織Iba-1表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠腦組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.05)，與模型組比較，針刺組大鼠腦組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞減少(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腦組織區(qū)見(jiàn)少量小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞胞體瘦長(zhǎng)，有細(xì)長(zhǎng)的分枝狀突起，處于未活化狀態(tài)；模型組大鼠腦組織區(qū)見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞增多，胞體變大，突起粗大，呈活化狀態(tài)；針刺組大鼠腦組織區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞明顯少于模型組。見(jiàn)表2和圖2。

表1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

Tab.1 Comparison of spatial learning and memory ability of rats in each group

GroupsnEscape latency (s)Wearing indexSham operation group108.67±1.965.46±1.43Model group1018.24±4.951)2.04±0.651)Acupuncture group1012.47±2.831)2)3.52±0.871)2)F19.16227.371P<0.001<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

2.4各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.5各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖Fig.1 TTC staining of brain tissue of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死面積和腦組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞比較

Tab.2 Comparison of cerebral infarct size and brain tissue Iba-1 positive cells in each group

GroupsnCerebralinfarct size(%)Brain tissue Iba-1positive cellsSham operation group10-7.45±1.41Model group1042.15±4.481)27.38±4.721)Acupuncture group1031.23±3.141)2)16.57±3.091)2)F6.31288.310P<0.001<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖2 各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化免疫組化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of microglia in brain tissue of each group (×400)

表3 各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

Tab.3 Comparison of IL-6,IL-1β and TNF-α levels in brain tissue of rats in each group

GroupsnIL-6(pg/mg)IL-1β(pg/mg)TNF-α(pg/mg)Sham operation group1053.26±12.6316.46±12.3747.35±11.42Model group10175.35±34.211)42.34±16.531)98.26±17.531)Acupuncture group1096.24±18.561)2)27.48±14.211)2)62.14±13.471)2)F68.7208.05533.232P<0.0010.002<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖3 各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of IL-6,IL-1β and TNF-α mRNA in brain tissue of rats in each group

3 討論

新生兒缺氧缺血后可引起酸中毒、低血糖、氧自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、興奮毒作用、細(xì)胞因子釋放等變化，上述因素的變化及相互作用共同引起腦損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于胚胎前期骨髓干細(xì)胞，成熟后廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于休眠或靜息狀態(tài)，活性低，無(wú)抗原提呈功能，無(wú)吞噬功能，從而使腦內(nèi)免疫處于比較低的水平；在腦組織受到損傷等刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞可迅速活化，發(fā)生功能、形態(tài)、免疫顯型變化，引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，釋放大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞毒素，分泌炎性細(xì)胞因子[6,7]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞和促炎因子是神經(jīng)炎癥的特征性表現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，在腦組織受到缺氧缺血性損失時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞最先被活化，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變肥大，突起縮短，數(shù)量增加[8]，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有兩種作用：一方面可通過(guò)釋放大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗炎細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等吞噬損傷神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)血管生成、抑制炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；另一方面可釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子、氧自由基、一氧化氮等啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷[9,10]?？梢?jiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)神經(jīng)元和引起神經(jīng)元損傷的雙重作用，但過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞則是引起持續(xù)性炎癥反應(yīng)的主要原因，過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可引起IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的大量釋放，大量促炎細(xì)胞引起又可不斷活化小膠質(zhì)細(xì)胞，損傷神經(jīng)元，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)損傷[11,12]。

針刺治療缺氧缺血性腦損傷具有不可替代和特定的優(yōu)勢(shì)[13,14]，主要原理為針刺通過(guò)刺激人體經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)氣血運(yùn)行和人體臟腑器官功能，針刺具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)不良反應(yīng)、療效肯定的優(yōu)勢(shì)，有著極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[15,16]。靳三針療法是一種傳統(tǒng)針灸療法，近年來(lái)在針灸治療小兒腦病方面的研究取得了比較滿(mǎn)意的效果[17]。本文采用“靳三針療法”治療缺氧缺血性腦損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)針刺可顯著降低缺氧缺血性腦損傷大鼠逃避潛伏期、增加穿臺(tái)指數(shù)、減少腦梗死面積、降低腦組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平?？梢?jiàn)，針刺對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠具有腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能為缺氧缺血引起腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，大量生成的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子又進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞，形成惡性循環(huán)引起腦組織損傷；針刺通過(guò)降低缺氧缺血引起的腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化、降低IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用。

綜上所述，針刺可能通過(guò)降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用。