鄧燕群 劉翠玉 尹志華 張允奇 羅秀霞

(深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院檢驗科，深圳 518040)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是風(fēng)濕性疾病中最為常見的一種疾病，至今病因未明，目前大部分研究機構(gòu)認為，RA是由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的，其中約50%的RA發(fā)病與遺傳基因易感性有關(guān)[1，2]。RA是一種有遺傳傾向的多基因疾病，具有復(fù)雜的遺傳背景。國內(nèi)外已有很多RA基因多態(tài)性分析研究報道，但仍未找到特異性基因，且不同地區(qū)、不同人群SNP的基因多態(tài)性分布因遺傳背景和生活環(huán)境因素的不同而存在很大差異性[3，4]，同時還有研究表示，一些基因位點多態(tài)性與RA自身抗體、細胞因子及炎性物質(zhì)的產(chǎn)生也存在一定相關(guān)性[5，6]。因此，探索RA相關(guān)易感基因多態(tài)性及自身抗體、細胞因子及炎性物質(zhì)對RA發(fā)病機制的闡明、診斷、治療及研發(fā)基因治療靶點藥物具有重要臨床意義。為此，本文對深圳地區(qū)RA患者的IL-17F基因位點rs763780單核苷酸多態(tài)性及細胞因子、自身抗體和炎癥性物質(zhì)進行調(diào)查研究分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2016年1月～2018年10月來深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病?？漆t(yī)院就診的RA患者176例，其中男81例，女95例，年齡31～52歲，平均(40.62±10.25)歲，均符合2009年美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的RA診斷標準[1]，且3個月內(nèi)未接受免疫抑制劑及激素類藥物治療。并選取同期來院體檢的健康人群110例，其中男48例，女62例，年齡(30～53)歲，平均(41.63±11.05)歲。排除標準：①合并其他自身免疫性疾??；②孕產(chǎn)婦及哺乳期的婦女；③心功能不全及肝腎功能障礙者；④合并糖尿病、高血壓、急性感染及惡性腫瘤等疾病患者。確保兩組的年齡和性別等一般性資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署了自愿協(xié)議書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.1.2儀器與試劑 全血DNA基因組提取試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；CFX-96 PCR儀由美國Bio-Rad公司提供；紫外可見凝膠成像系統(tǒng)、核酸分析儀由德國Eppendorf公司提供；HSP92II限制性內(nèi)切酶由美國Fermentas公司提供；去核酸酶水、PreMix Taq DNA聚合酶由美國Promega公司提供；瓊脂糖凝膠由西班牙Biowest公司提供；IL-17試劑盒由美國Rapidbio公司提供；DXC600全自動生化分析儀由美國Bankman公司提供。

1.2方法

1.2.1標本采集 所有研究對象采集靜脈血5～6 ml，其中2 ml加入EDTA-K2抗凝管內(nèi)混勻用于全血DNA提取用；剩余的血加入一次性無抗凝劑干燥管內(nèi)，用于IL-17、RF及CRP檢測用，均及時送檢。

1.2.2IL-17、RF及CRP檢測 IL-17含量采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，RF和CRP采用免疫比濁法檢測，所有操作均嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行。

1.2.3DNA提取 全血DNA基因組提取采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒進行提取，操作按試劑盒說明書進行，DNA提取完成后通過電泳檢測其是否完整，并采用紫外分光光度儀檢測其濃度以及純度，合格后置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4IL-17F基因位點rs763780多態(tài)性分析 ①引物設(shè)計：引物利用Primer Premier 5軟件設(shè)計，引物為F：5′-GGGAATGCAAACAAACACCTGAA-3′，R：5′-CCGTTCCCATCCAGCAAGAGA-3′;②PCR反應(yīng)體系：總體積6.4 μl，其中DNA模版1 μl、10 μmol/L的上下游引物各0.2 μl、去核酸酶水2 μl、PreMix Taq DNA聚合酶3 μl；③PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min→95℃變性30 s→60℃30 s→72℃延伸30 s，反復(fù)循環(huán)36次→72℃延伸5 min；④電泳：于5 μl 的PCR擴增產(chǎn)物中加入2 μl限制性內(nèi)切酶，37℃孵育6 h以上，于酶切后的PCR產(chǎn)物中加入3%的瓊脂糖凝膠，經(jīng)Goldview染色，置于250 V電壓下進行電泳，然后利用Bio-Rad凝膠成像儀檢測分型結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1兩組Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 經(jīng)χ2檢驗，RA組和對照組IL-17F基因位點rs763780位點實際基因型分布與Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下的理論分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.290 3，P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，達到遺傳平衡，具有群體代表性。

2.2兩組血清中IL-17、RF及CRP含量比較 RA組血清中IL-17、RF及CRP含量分別為(36.73±11.06)pg/ml，(58.05±14.92)U/ml和(32.15±13.96)mg/L，明顯高于對照組的(14.52±6.35)pg/ml，(10.24±5.32)U/ml和(6.81±3.25)mg/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.035 7～5.320 6，P<0.05)。

2.3兩組IL-17F基因位點rs763780基因型及等位基因頻率比較 RA組CC基因型和C等位基因檢出率分別為19.32%和41.48%，明顯高于對照組的6.36%和26.82%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.916 5～5.054 7，P<0.05)，結(jié)果見表1。

表2 RA組基因型血清中IL-17，RF及CRP含量比較

Tab.2 Comparison of IL-17,RF and CRP in genotype serum of RA group

ItemCC genotypeCT genotypeTT genotypetPIL-17(pg/ml)42.96±13.6430.25±10.7426.07±9.522.7163-3.5750<0.05RF(U/ml)57.02±13.0356.58±12.3959.85±15.760.6815-0.9371>0.05CRP(mg/L)35.19±14.3232.53±12.8729.74±11.300.8573-1.1203>0.05

表1 RA組與對照組IL-17F基因位點rs763780基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

Tab.1 Comparison of rs763780 genotype and allele frequency of IL-17F locus in RA group and control group[n(%)]

GroupsnGenotype frequencyCCCTTTAllele frequencyCTRA17634(19.32)78(44.32)64(36.36)146(41.48)206(58.52)Control1107( 6.36)45(40.91)58(52.73)59(26.82)161(73.18)

圖1 IL-17F基因位點rs763780擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of rs763780 amplification product of IL-17F gene locusNote:M.Marker;1 and 2.CT genotypes; 3,6 and 8 .TT genotypes; 4,5,and 7.CC genotypes.

2.4電泳結(jié)果 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，IL-17F基因位點rs763780分別于407、290及117 bp處顯色檢出TT、CT及CC三種基因型，結(jié)果見圖1。

2.5RA組基因型血清中IL-17、RF及CRP含量比較 RA組IL-17F基因位點rs763780 CC基因型中的IL-17水平為(42.96±13.64)pg/ml，明顯高于其他基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而三種基因型血清中RF和CRP水平之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表2。

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，我國發(fā)病率約為0.24%～0.5%，女性多于男性，約為2～3∶1，主要表現(xiàn)為局部關(guān)節(jié)在早晨起床時不靈活、關(guān)節(jié)畸形、疼痛、腫脹、錯位等，并伴有不同程度的疲乏、低熱和體重減輕[7]，嚴重者病變還會累及全身各個器官，引起類風(fēng)濕病，且RA為一種反復(fù)發(fā)作性疾病，致殘率較高，嚴重影響患者的生存質(zhì)量和身體健康，且預(yù)后不良，目前還沒有很好的根治方法，早期診斷并積極誘導(dǎo)疾病緩解是防治并發(fā)癥的關(guān)鍵[8]。因此，加強RA發(fā)病機制的研究對RA的早期診斷、治療、預(yù)防及基因靶向治療藥物的研發(fā)具有重要的意義。

RA發(fā)病機制十分復(fù)雜，據(jù)有關(guān)文獻結(jié)論顯示，多種細胞因子、自身抗體及炎性物質(zhì)通過相互調(diào)節(jié)、相互影響直接或者間接參與RA的發(fā)生和發(fā)展過程[9]。其中IL-17是一種由Th17細胞所分泌的促炎細胞因子，可誘導(dǎo)黏附分子、蛋白酶以及其他細胞因子的產(chǎn)生，在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮作用[10]。RF是一種抗人IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體，最初于1984年在RA患者血清中被發(fā)現(xiàn)。CRP是一種由肝細胞所合成，具有激活補體和促進粒細胞及巨噬細胞的吞噬作用的急性時相反應(yīng)蛋白，在急性創(chuàng)傷和感染時其濃度急劇升高。有關(guān)研究表明，IL-17、RF及CRP濃度在RA患者血清中明顯升高。本研究結(jié)果顯示，RA組血清中IL-17，RF及CRP濃度明顯高于對照組健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與國內(nèi)外有關(guān)研究結(jié)論一致[5,6,8,11]，說明了IL-17，RF及CRP與RA疾病的發(fā)生和發(fā)展具有一定的相關(guān)性，對RA的診斷、療效判斷具有一定的參考價值。

目前為止，RA的病因仍不清楚，可能與環(huán)境、免疫及遺傳因素等有關(guān)，其中約50%的RA發(fā)病與遺傳基因易感性有關(guān)[12，13]。至今為止，已發(fā)現(xiàn)40多個與RA相關(guān)的SNP位點，IL-17F基因為其中之一[14]。IL-17F是由Th17細胞分泌的一種促炎因子，可誘導(dǎo)多種細胞因子和趨化因子的表達，從而加劇滑膜的炎癥反應(yīng)及骨質(zhì)的破壞[15]。近年來，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IL-17F基因多個位點上存在基因突變，但不同地區(qū)和人群的遺傳背景、生活習(xí)慣及環(huán)境等因素的不同而導(dǎo)致SNP的基因多態(tài)性分布存在很大差異性，如有關(guān)文獻報道IL-17F基因某些突變與RA發(fā)病存在密切關(guān)系[7，9]，而另外有些研究卻未發(fā)現(xiàn)IL-17F基因多態(tài)性與RA易感性相關(guān)[10，16]。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)RA患者IL-17F基因位點rs763780 CC基因型及C等位基因檢出率明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與國內(nèi)外部分文獻研究的結(jié)論相一致[7，9]，這可能與IL-17F基因位點rs763780 CC基因型及C等位基因是導(dǎo)致本地區(qū)RA發(fā)病的遺傳易感基因等有關(guān)，且CC基因型突變RA患者血清中IL-17濃度明顯高于其他基因突變類型的RA患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而RF和CRP濃度改變與IL-17F基因位點rs763780基因型突變類型無關(guān)聯(lián)性，這可能與CC基因型突變僅影響到了IL-17的表達并改變細胞因子的結(jié)構(gòu)等有關(guān)[14，17]，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，RA發(fā)病機制十分復(fù)雜，IL-17、RF及CRP在RA患者血清中明顯升高，同時IL-17F基因位點rs763780的SNP多態(tài)性分布與RA的發(fā)生和發(fā)展有密切相關(guān)性，且不同地區(qū)、不同人群因遺傳背景和生活環(huán)境因素的不同而存在很大差別。因此，加強不同地區(qū)、不同人群RA易感基因SNP多態(tài)性調(diào)查分析有助于RA的發(fā)病機制闡明，并為RA的診斷、治療和預(yù)后判斷提供有效的遺傳標志物。