余 靜 朱應成 祁 俊 梁朝鋒 徐 斌

安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖 241000

川歸補腎通絡方（丹參、炮山甲、龜甲、龍血竭、當歸、川芎、地龍、土鱉蟲、鹿茸、人中黃、淫羊藿、肉桂、三七、冰片、海星），具有補益肝腎、活血通絡、強筋健骨、行氣止痛之功效，臨床應用于血瘀、肝腎虧虛型股骨頭缺血性壞死，癥見疼痛、活動不利、骨不愈合等。

本課題組已在前期研究中建立了川歸補腎通絡膠囊的質(zhì)量標準[1]，并運用現(xiàn)代中藥制藥技術(shù)將其制備成適合大生產(chǎn)的川歸補腎通絡膠囊。但由于中藥復方制劑的藥味較多，具有多成分多靶點的特點，各成分有其獨特的藥理活性，因此中藥制劑的療效亦是方中眾多共存活性成分相互作用的結(jié)果，若僅采用單一指標成分進行評價，恐難以全面把控中藥復方制劑的內(nèi)在質(zhì)量、臨床療效。因此，本研究選取本方的代表藥材丹參中的兩個主要活性成分丹酚酸B 和丹參酮ⅡA[2-6]，作為川歸補腎通絡膠囊的質(zhì)量評價指標，建立高效液相色譜法同時測定其含量的方法，共同監(jiān)控本制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters e2695 型高效液相色譜儀[含二極管陣列檢測器（PDA），美國沃特世公司]；萬分之一電子天平（XP-205、AL-204，梅特勒-托利多儀器有限公司）。

川歸補腎通絡膠囊（安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院自制，規(guī)格：0.3 g/粒，批號：180801、180802、180803）；丹酚酸B 對照品、丹參酮ⅡA 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為：111562-201212、110766-2010619，純度分別為95.4%、100%）；甲醇、乙腈和磷酸為色譜純；水（“娃哈哈”純凈水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)；流動相A 為乙腈（A）、B 為0.1%磷酸溶液，二元梯度洗脫：0～16 min A：24%，17～32 min A：75%，33～35 min A：24%；流速為1.0 mL/min；檢測波長為270 nm（丹參酮ⅡA）、286 nm（丹酚酸B）；柱溫為20℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取丹酚酸B 46.99 mg 至50 mL 量瓶中，丹參酮ⅡA 對照品19.20 mg至200 mL 量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為896.6、96 μg/mL 的丹酚酸B 對照品儲備液、丹參酮ⅡA 對照品儲備液。精密吸取丹酚酸B對照品儲備液5 mL 及丹參酮ⅡA 對照品儲備液1 mL 共同加入至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到丹酚酸B 及丹參酮ⅡA 濃度分別為448.3、9.6 μg/mL 的混合對照品溶液，冷藏保存，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的川歸補腎通絡膠囊內(nèi)容物，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率350 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱重，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取缺丹參的其余藥材，按本制劑的制備工藝制成缺丹參的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成陰性空白溶液。

2.3 專屬性試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣。供試品色譜中，在與各對照品色譜峰相應保留時間處有吸收峰，各待測成分與相鄰色譜峰分離度均＞1.5，而陰性樣品溶液中未見相應待測成分色譜峰。見圖1。

2.4 線性關(guān)系的考察

圖1 川歸補腎通絡膠囊HPLC 色譜圖

分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL 至2 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），以對照品峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結(jié)果丹酚酸B 的回歸方程為Y=12 650X-1973.3（r=0.9996）、丹參酮ⅡA 的回歸方程為Y=54 274X+22 206，（r=0.997）。結(jié)果表明，丹酚酸B 進樣濃度在44.83～448.30 μg/mL 范圍內(nèi)，丹參酮ⅡA 進樣濃度在0.96～9.60 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液（丹酚酸B 44.83 μg/mL、丹參酮ⅡA 49 μg/mL），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，結(jié)果丹酚酸B、丹參酮ⅡA 的峰面積RSD 均為0.4%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取混合對照品溶液（丹酚酸B 44.83 μg/mL、丹參酮ⅡA 49.0 μg/mL），按“2.1”項下色譜條件，分別于1、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄色譜圖，結(jié)果丹酚酸B、丹參酮ⅡA 峰面積RSD 分別為1.3%、1.5%，表明在24 h 內(nèi)各化合物穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取川歸補腎通絡膠囊內(nèi)容物（批號：180801）共6 份，每份約1 g，精密稱定，分別置于6 個50 mL 置具塞錐形瓶中，按照“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，按外標法計算丹酚酸B、丹參酮ⅡA 的含量分別為7.65 mg/g、211.77 μg/g，RSD 分別為1.1%、0.7%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的川歸補腎通絡膠囊內(nèi)容物（批號：180801）共6 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于6 個50 mL 量瓶中，分別精密加入丹酚酸B 對照品儲備液、丹參酮ⅡA 對照品儲備液適量，加70%甲醇至刻度，按照“2.2.2”項下方法進行制備，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率。丹酚酸B、丹參酮ⅡA的平均加樣回收率分別為99.7%、97.4%，RSD 分別為1.9%、1.7%。見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定

分別取3 批川歸補腎通絡膠囊內(nèi)容物（批號：180801、180802、180803）約1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，按照“2.2.2”項下方法進行制備，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，按外標法計算丹酚酸B、丹參酮ⅡA 的含量。見表2。

表2 3 批樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 指標性成分的選擇

川歸補腎通絡方中丹參具有補氣升陽、生津養(yǎng)血、行滯通痹的功效，可用于治療氣虛乏力、中氣下陷、血虛萎黃、半身不遂、痹痛麻木等癥[7]。主要化學成分有丹參酮、丹參酚酸類、揮發(fā)油及無機元素等，其中以水溶性成分丹酚酸B 和脂溶性成分丹參酮ⅡA 最具有代表性，發(fā)揮抗炎、抗血栓、改善血液循環(huán)[5]，促進成骨細胞分化、增殖等藥理作用[8-12]，是川歸補腎通絡膠囊治療股骨頸骨折術(shù)后股骨頭缺血性壞死的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本研究選擇丹酚酸B、丹參酮ⅡA 作為川歸補腎通絡膠囊含量測定的指標性成分。

3.2 檢測波長的選擇

本研究利用二極管陣列檢測器對丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 進行光譜掃描，得到2 個待測組分在210～400 nm 波長范圍內(nèi)的紫外吸收圖譜，確定各成分的最大吸收波長，并結(jié)合相關(guān)文獻[13-14]，采用雙波長同時測定，保證2 個待測成分均在最大吸收波長下檢測，檢測靈敏度高、干擾小，檢測波長分別為270 nm（丹參酮ⅡA）、286 nm（丹酚酸B）。

3.3 流動相的選擇

已有文獻報道高效液相色譜法定量測定含丹參中藥制劑中的丹酚酸B 和丹參酮ⅡA，常采用乙腈-磷酸水[15-17]、乙腈-甲酸水[18-19]、甲醇-磷酸水[20]等流動相系統(tǒng)進行洗脫。本研究考察了乙腈、甲醇、磷酸、水等多個不同組合，經(jīng)過對比選取乙腈-0.1%磷酸水作為流動相，并優(yōu)化梯度洗脫條件，在一個流動相系統(tǒng)下實現(xiàn)丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的良好分離，且峰形對稱，與相鄰色譜峰未見干擾[21-24]。

3.4 樣品提取工藝的選擇

本研究以丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的含量為評價指標，單因素考察了川歸補腎通絡膠囊的提取方式（超聲、回流）、提取時間（0.5、1 h）、提取溶劑（70%甲醇、90%甲醇），確定川歸補腎通絡膠囊的最佳提取工藝為加70%甲醇50 mL 超聲處理30 min[21]。該樣品前處理條件簡便，可有效避免因前處理過程繁瑣而造成的含量測定結(jié)果誤差。

3.5 實驗溫度條件的選擇

丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 在高溫及日光下易降解，所以實驗過程中對照品及樣品溶液應避光冷藏保存，并參考2015 年版《中華人民共和國藥典》將柱溫設置為20℃[7]。

4 結(jié)論

本研究首次建立高效液相色譜法同時定量測定川歸補腎通絡膠囊中丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的方法，經(jīng)驗證所建立的含量測定方法操作簡便、重復性好，結(jié)果準確可靠，對多種處方中含丹參的中藥制劑的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持和有益參考。