李 欣 李 芳 王 媛 張寶玉 張麗潔

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心，北京 101149；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，山西太原 030001

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）具有較高的致殘率，目前尚無有效方法逆轉(zhuǎn)或修復(fù)軟骨與骨的破壞。破骨細(xì)胞在維持骨吸收和骨形成的過程中起著重要的作用[1]。NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子，其介導(dǎo)的NF-κB 信號通路對誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成、活化，抑制破骨細(xì)胞凋亡有著重要的作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，RANKL 介導(dǎo)的NF-κB 信號通路的激活與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、c-fos、活化T 細(xì)胞核因子1（NFATc1）等物質(zhì)有關(guān)[4-5]?？鄥A具有免疫抑制作用[6]，其可能與NF-κB 信號通路有關(guān)。本研究將通過體外實驗，探索苦參堿對RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及c-fos、TRAF6、NFATc1 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞（湖南豐暉生物科技有限公司，CL0266）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，12100）中，在恒溫培養(yǎng)箱中以5% CO2、37℃及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2 分組

根據(jù)加入破骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑RANKL（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，P00226-50 μg）及不同劑量苦參堿（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，SM8130-20 mg）分為五組，即空白組（A 組）、誘導(dǎo)組（B 組）、苦參堿低劑量組（0.5 mg/mL，C 組）、苦參堿中劑量組（1 mg/mL，D 組）、苦參堿高劑量組（2 mg/mL，E 組）。

1.3 TRAP 染色

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，3000 r/min，半徑10 cm，離心3 min，棄上清，取細(xì)胞懸液300 μL 在6 孔板上爬片，誘導(dǎo)、給藥，7 d 后TRAP 染色（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，G1492），顯微鏡觀察多核破骨細(xì)胞。

1.4 甲苯胺藍染色

誘導(dǎo)給藥12 d 后，每孔加入1 mL 甲苯胺藍染色液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，G3660）染色，水洗，晾干，顯微鏡觀察骨吸收陷窩。

1.5 qPCR

誘導(dǎo)給藥48 h 及9 d 后分別檢測TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及Calcr、Ctsk mRNA 的表達量。方法：各組中加入1 mL Trizol（北京全式金生物技術(shù)有限公司，H10318）提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用Real-time PCR 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，AQ131-01）擴增目的基因，上海晶萊生物技術(shù)有限公司合成引物（Calcr F 5′-GAAGTGCCCGCTGATGCCT-3′，R 5′-TGGCTCTCCTGACTTGGTGTT-3′；Ctsk F 5′-CACCCTTAGTCTTCCGCTCA-3′，R 5′-CTTGAACACCCACATCCTGCT-3′；TRAF6 F 5′-CAGCGTGTACGATCGGGTT-3′，R 5′-AAGACCCAAGTTTCCGTGCC-3′；c-fos F 5′-GGCAGAAGGGGCAAAGTAGA-3′，R 5′-GTTGATCTGTCTCCGCTTGG-3′；NFATc1 F 5′-CGTACCTTCCTGCCAATGGT-3′，R 5′-GGGCTATCACGTGGTGTGAA-3′），經(jīng)95℃5 min 預(yù)變性，95℃15 s變性、60℃1 min 退火，共40 個循環(huán)，后以95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，導(dǎo)出熔解曲線，計算Ct 值，GAPDH 為管家基因，用2-ΔΔct法算出Calcr、Ctsk、TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量。

1.6 Western blot

誘導(dǎo)給藥48 h 后，各組中加入蛋白提取液獲得樣品，行SDS-PAGE 凝膠電泳、上樣，轉(zhuǎn)膜后封閉，TRAF6、c-fos、NFATc1 一抗孵育，清洗，二抗孵育，清洗，ECL 顯色曝光后進行圖像處理，進行TRAF6、cfos、NFATc1 蛋白定量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，進一步兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAP 染色

RANKL 誘導(dǎo)后，鏡下可見大量多核破骨細(xì)胞，苦參堿干預(yù)后，鏡下多核破骨細(xì)胞較B 組減少，以D 組、E 組效果為著。見圖1。

圖1 各組甲基綠染色情況（400×）

2.2 Calcr 和Ctsk mRNA 表達量

與A 組比較，B 組Calcr、Ctsk mRNA 表達量明顯增加（P <0.01）。與B 組比較，C、D、E 組Calcr 和Ctsk mRNA 表達量減少（P<0.05）。C、D、E 組Calcr 和Ctsk mRNA 表達量兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05），且隨苦參堿濃度增加，Calcr 和Ctsk mRNA 表達量呈逐漸降低趨勢，呈劑量依賴性。見圖2。

2.3 甲苯胺藍染色

B 組骨吸收陷窩較A 組增加。與B 組比較，E 組骨吸收陷窩明顯減少。見圖3。

2.4 TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量

圖2 各組Calcr 和Ctsk mRNA 表達量比較

圖3 各組甲苯胺藍染色（400×）

與A 組比較，B 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表達量明顯升高（P <0.01）。與B 組比較，C、D、E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量明顯下降（P <0.01），且呈劑量依賴性。C、D、E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A 組和E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。見圖4。

2.5 TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達

與A 組比較，B 組TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達量明顯增多。與B 組比較，C、D、E 組TRAF6、cfos、NFATc1 蛋白表達量均下降，且呈劑量依賴性。A 組與E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達量比較無明顯差異。見圖5。

圖4 各組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量比較

3 討論

RA 是一類具有較高致殘率的自身免疫性疾病，骨量減少與骨質(zhì)破壞是RA 致殘的主要原因。而破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一具有骨質(zhì)破壞能力的細(xì)胞[1]。近年來破骨細(xì)胞活化機制的研究已成為熱點[7]。RANKL 分泌增加則是破骨細(xì)胞分化的必要條件[8]。而RANKL介導(dǎo)的NF-κB 信號通路對破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要。RANKL 可與RANK 結(jié)合，使其與下游TRAF6 結(jié)合，活化NF-κB，促進c-fos 基因表達，c-fos 則可進一步與NFATc1 結(jié)合并相互作用，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[9-10]。

圖5 各組TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達

苦參是一種天然中草藥，可用于治療感染、惡性腫瘤等疾病[11]。苦參堿作為其主要成分之一，具有免疫抑制作用[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等促炎因子減輕關(guān)節(jié)炎鼠關(guān)節(jié)腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)[14]。此外，苦參堿衍生物M19 也被人證實具有相同的作用[15]。

近年苦參堿對破骨細(xì)胞作用機制的研究逐漸增多，發(fā)現(xiàn)其可抑制TLR4 和c-Jun 表達，選擇性下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)體外破骨細(xì)胞TNF-α 和IL-1β 的表達[16]。Chen 等[17]發(fā)現(xiàn)，苦參堿可降低血清中前炎性因子TRAcp5b、TNF-α 和IL-6 的水平，抑制NF-κB 等多條信號通路，進而抑制破骨細(xì)胞分化。同期研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可調(diào)節(jié)Th1、Th2 反應(yīng)不平衡狀態(tài)，考慮可能與NF-κB 信號通路作用于T 細(xì)胞有關(guān)[18]。

此外，M19 可在體外抑制MAPKs 磷酸化及NFκB 活性，誘導(dǎo)RA-FLS 凋亡，抑制促炎細(xì)胞因子及MMP-1、MMP-3、MMP-13 的表達[15]。同時Chen 等[19]發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S5（RPS5）與M19 可協(xié)同抑制破骨細(xì)胞形成。而苦參堿的另一種衍生物——M54 也可靶向作用于RPS5，抑制破骨細(xì)胞生成[20]。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可作用于RANKL 介導(dǎo)的NF-κB 信號通路，但對該通路中所涉及的TRAF6、c-fos、NFATc1 相關(guān)分子的研究甚少。因此，本實驗初步探究了苦參堿對RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及TRAF6、c-fos、NFATc1 表達的影響。

本實驗誘導(dǎo)組鏡下可見大量多核破骨細(xì)胞、骨吸收陷窩，且Calcr、Ctsk mRNA 表達量較空白組明顯升高，考慮破骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。隨苦參堿濃度增加，多核破骨細(xì)胞數(shù)量、骨吸收陷窩及Calcr、Ctsk mRNA 表達量呈逐漸下降趨勢，且呈劑量依賴性。此結(jié)果同Chen等[17]報道結(jié)果一致。此外，誘導(dǎo)組中TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及蛋白的表達量最高，提示破骨細(xì)胞活化與TRAF6、c-fos、NFATc1 分子有關(guān)。而隨苦參堿濃度的增加，TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及蛋白的表達量呈逐漸下降趨勢，考慮可能的機制：苦參堿抑制TRAF6 表達，干擾其與RANK 結(jié)合，抑制NF-κB活化、c-fos、NFATc1 表達，最終致破骨細(xì)胞活化障礙。該結(jié)果為苦參堿抑制破骨細(xì)胞分化相關(guān)機制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，但苦參堿對破骨細(xì)胞抑制作用的最佳藥物濃度仍有待進一步驗證。