張金輝，池明，*，Yu Xiang，王遠(yuǎn)宏，李二峰，劉慧芹，馬睿

（1.天津農(nóng)學(xué)院，天津300384；2.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部太平洋食品研究中心，薩莫蘭不列顛哥倫比亞省V0H 1Z0，加拿大）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬茄科一年生草本植物，塊莖可供食用，是全球第四大重要的糧食作物，僅次于小麥、稻谷和玉米。馬鈴薯又稱地蛋、土豆、洋山芋等，茄科植物的塊莖，與小麥、稻谷、玉米、高粱并成為世界5 大作物。馬鈴薯主要生產(chǎn)國(guó)有中國(guó)、俄羅斯、印度、烏克蘭、美國(guó)等。中國(guó)是世界馬鈴薯總產(chǎn)最多的國(guó)家。2015 年，中國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，推進(jìn)把馬鈴薯加工成饅頭、面條、米粉等主食，馬鈴薯成為稻米、小麥、玉米外的又一主糧[1]。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是動(dòng)植物和真菌中普遍存在的一類(lèi)含銅氧化酶，PPO 催化內(nèi)源酚類(lèi)物質(zhì)氧化為醌，醌再經(jīng)過(guò)聚合形成色素，是引起馬鈴薯褐變的主要酶類(lèi)[2-3]。

植物中多酚氧化酶通常由核基因編碼，多基因控制，具有時(shí)空表達(dá)特性[4-7]。Thygesen 等[7]報(bào)道，馬鈴薯多酚氧化酶基因（PPO）包含5 個(gè)～6 個(gè)成員，POTP1/P2（GenBankID：M95196/M95197），POT32（U22921），POT33（U22922）和 POT72（U22923）[8]，它們均缺乏內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。它們的核酸序列間享有70%～82%的同源性，屬于組成型PPO 基因，具空間表達(dá)特性[9]。植物PPO 多定位于葉綠體類(lèi)囊體腔或線粒體中[10-11]。而金魚(yú)草（Antirrhinum majus）PPO 不具轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu)，定位于液泡[12]。典型的PPO 包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：N 末端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，中部高度保守的Cu 結(jié)合區(qū)和C 末端疏水結(jié)構(gòu)區(qū)。高度保守的銅結(jié)合區(qū)包含CuA 和CuB，負(fù)責(zé)銅與氧分子及酚類(lèi)底物的協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)[13-15]。馬鈴薯PPO 功能的研究主要集中在與經(jīng)濟(jì)指標(biāo)相關(guān)的酶促褐變反應(yīng)上[16]。工業(yè)中，常使用酶活性抑制劑[17]和物理法[18-19]使PPO 活性降低甚至喪失。科研中，常采用轉(zhuǎn)基因的方法將正義、反義或雙鏈RNA 轉(zhuǎn)入植物抑制PPO 基因表達(dá)，減少褐變的發(fā)生[20-23]。

本試驗(yàn)通過(guò)檢索馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)獲得馬鈴薯所有PPO 成員，并對(duì)成員基因StuPPO9 進(jìn)行分離鑒定、表達(dá)載體構(gòu)建和煙草遺傳轉(zhuǎn)化，為后期基因功能的研究提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“大西洋”品種馬鈴薯：天津天興佳業(yè)科技有限公司；離心柱型植物總RNA 提取試劑盒、離心柱型Plant Genomic DNA Kit、pEASYR-T3 Cloning Kit 克隆試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)：Promega 生物技術(shù)有限公司；Eppendorf 冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德生命科學(xué)有限公司、Bio-rad 梯度PCR 儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司、限制性內(nèi)切酶BamHI 和PstI（NEB）和pCambia2301-ky 載體：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯中PPO 類(lèi)似基因的檢索

搜索GenBank 中已被確認(rèn)的馬鈴薯PPO 基因信息，包括 StuPPO1（GenBank ID：15M95196/ M95197）、StuPPO2 （U22921）、StuPPO3 （U22922） 和 StuPPO4（U22923）。利用 US Joint Genome Institute 庫(kù)，在馬鈴薯基因組序列中，選擇blastn 系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)，根據(jù)上述已知基因序列對(duì) PPO 類(lèi)似基因進(jìn)行搜索。手動(dòng)檢查BLAST 得到的結(jié)果，并查找PPO 類(lèi)似基因序列。使用NCBI BLAST platform、Vector NTI Advance 11 software和Simple ModularArchitecture Research Tool 等軟件對(duì)得到的序列進(jìn)行分析和整理。

1.3.2 StuPPO9 基因引物的設(shè)計(jì)與合成

運(yùn)用Primer 3（version 0.4.0）引物設(shè)計(jì)軟件，從GenBank 和HarvEST 庫(kù)中搜集下載數(shù)據(jù)，并從獲得的數(shù)據(jù)中得到特異核苷酸序列區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)。特異性引物如下：

STPO-F（上游引物）：5′-ATGTTCATGAATACATCTCAAAC-3′

STPO-R（下游引物）：5′-CTAATCCTCAAGCACAATC-3′

擴(kuò)增目的產(chǎn)物大小為1884bp，引物序列進(jìn)行合成。

1.3.3 植物總RNA 提取

取大西洋馬鈴薯葉片用錫箔紙包裹置于液氮中，取200 mg 的冷凍樣品組織，迅速放入研缽中研磨成細(xì)粉末狀，RNA 提取過(guò)程遵循試劑盒（離心柱型）的步驟。提取的RNA 置于-80 ℃冰箱中待用。

1.3.4 第一條鏈cDNA 的合成

cDNA 的合成依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將得到的cDNA 放在4 ℃條件的冰箱中暫存。

1.3.5 gDNA 的提取

gDNA 的提取依照Plant Genomic DNA Kit（離心柱型）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將所得溶液收集到離心管中放在-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 目的基因的PCR 擴(kuò)增和克隆測(cè)序

利用StuPPO9 特異性擴(kuò)增引物，分別以cDNA 和gDNA 為模板擴(kuò)增目的基因。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱 5 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；重復(fù)循環(huán) 30 次；72 ℃延伸10 min；恒溫。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，GoldView1 染色檢測(cè)產(chǎn)物大小，再回收目的片段。擴(kuò)增所得DNA 片段，按照pEASYRT3 Cloning Kit 載體說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行StuPPO9 基因的連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，隨后挑選出白色的陽(yáng)性克隆，接種在LB 培養(yǎng)基上，于200 r/min，37 ℃培養(yǎng)6 h，菌液送公司測(cè)序。

1.3.7 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHI 和PstI 雙酶將PCR 產(chǎn)物和pCambia2301-ky 載體的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行切膠回收，回收的目的片段用T4 DNA Ligase 與pCambia2301-ky 進(jìn)行連接，16 ℃靜置過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序正確的重組載體命名為pCambia2301-StuPPO9。轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，待完全吸收后，倒置平皿，37 ℃恒溫培養(yǎng)約12 h。培養(yǎng)完成后，在LB 培養(yǎng)基中挑選最佳生長(zhǎng)的白色陽(yáng)性克隆，接種到50 mL 含有氨芐青霉素（ampicillin，Amp）的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h。隨后依照重組質(zhì)粒的提取方法操作，將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取后送往公司進(jìn)行測(cè)序，確定序列正確后進(jìn)行植株轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.3.8 煙草的基因轉(zhuǎn)化

應(yīng)用煙草中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法[24]，將pCambia2301-ky 載體轉(zhuǎn)入煙草中。轉(zhuǎn)基因煙草株系首先在含有卡那霉素硫酸鹽的培養(yǎng)集中篩選，隨后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）篩選。將卡那霉素硫酸鹽和PCR 篩選陽(yáng)性株系栽培于溫室中。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于基因組的馬鈴薯PPO家族基因分析

利用US Joint Genome Institute 基因組庫(kù)，對(duì)馬鈴薯基因組檢索，共檢索到9 個(gè)PPO 相似基因，分別命名為StuPPO1 至StuPPO9。其中StuPPO5-9 是新檢索得到的馬鈴薯PPO 基因。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，StuPPO1 至StuPPO8 均位于8 號(hào)染色體上，而StuPPO9則位于2 號(hào)染色體。StuPPO1 和StuPPO6 位置相鄰，位于 47 kb 的一個(gè)區(qū)域內(nèi)，而 StuPPO2、StuPPO3、StuPPO4、StuPPO5，StuPPO7 和 StuPPO8 則串聯(lián)在長(zhǎng)度為144 kb 的另一區(qū)域內(nèi)。這兩個(gè)區(qū)域在8 號(hào)染色體上間隔2 072 kb。與其他PPO 基因不同，StuPPO8 和StuPPO9 含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。

表1 馬鈴薯PPO 基因家族基因組分析Table 1 Genomic analysis of potato PPO gene family

續(xù)表1 馬鈴薯PPO 基因家族基因組分析Continue table 1 Genomic analysis of potato PPO gene family

根據(jù)核酸序列分析，StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4 間享有70%～82%的同源性，并分別對(duì)應(yīng)先前報(bào)道的 POTP1/P2，POT32，POT33 和 POT72。EST庫(kù)資料顯示，StuPPO1-StuPPO4，在馬鈴薯不同發(fā)育期的組織中都有表達(dá)。StuPPO5-9 是新檢索到的PPO 基因。其中StuPPO5-7 在EST 中的數(shù)據(jù)較少，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)StuPPO8。說(shuō)明它們很可能在馬鈴薯中表達(dá)量很少或僅在特殊狀態(tài)下誘導(dǎo)表達(dá)。

2.2 PPO蛋白區(qū)域和蛋白質(zhì)特征的分析

采用SignalP 和iPSORT Prediction 在線分析軟件預(yù)測(cè)9 個(gè)PPO 的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)除StuPPO2 和StuPPO4 存在線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域、StuPPO6 不具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu)外，其他PPO 基因均存在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。各PPO 成員均包含高度保守的Cu 結(jié)合區(qū)。對(duì)PPO類(lèi)似基因編碼的氨基酸序列的分析，表明上述基因編碼的氨基酸都含有3 個(gè)典型PPO 蛋白區(qū)域：酪氨酸酶區(qū)域（pfam00264），PPO1-DWL 區(qū)域（pfam12142）和PPO1-KFDV 區(qū)域 （pfam12143），StuPPO5 和 StuPPO7的酪氨酸區(qū)域比其它PPO 基因的短。StuPPO1-9 蛋白的區(qū)域名、重復(fù)序列和蛋白質(zhì)特征見(jiàn)表2。

表2 StuPPO1-9 蛋白的區(qū)域名、重復(fù)序列和蛋白質(zhì)特征Table 2 Region names，repeats and protein profiles of the StuPPO1-9 protein

2.3 StuPPO9基因的分離和鑒定

以大西洋馬鈴薯葉片為試材，參考馬鈴薯基因組中StuPPO9 預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)特異性引物，分別以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 和gDNA 為模板進(jìn)行克隆。以cDNA 為模板擴(kuò)增后獲得1 780 bp 的單一條帶，挑取兩個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒的提取和測(cè)序，見(jiàn)圖1。

結(jié)果表明，兩個(gè)克隆序列完全一致，與XM_0063-47021.2 一致性為98.4%。經(jīng)gDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增和克隆，核實(shí)該基因存在一個(gè)104 bp 的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

2.4 馬鈴薯StuPPO9基因的同源性分析

運(yùn)用 MEGA7.0 軟件對(duì)番茄 PPO A、PPO E、PPO F、PPO D、PPO B[8]和馬鈴薯 StuPPO1-9 進(jìn)行 DNA 序列同源性比對(duì)，并運(yùn)用軟件構(gòu)建基因親緣關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)如圖2。

圖1 StuPPO9 基因克隆Fig.1 Amplification of StuPPO9 gene

圖2 馬鈴薯與番茄PPO 基因序列進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Potato and tomato PPO gene sequence evolution tree

結(jié)果表明，StuPPO9 與 StuPPO2、PPO D 的基因親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與StuPPO4、PPO A、StuPPO3、PPO B、StuPPO6、PPO E、PPO F、StuPPO1、StuPPO5、StuPPO7 基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，StuPPO8 和StuPPO9 因在茄科多酚氧化酶基因家族中含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，而處于離其他PPO 較遠(yuǎn)的分枝中。

2.5 StuPPO9啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)

根據(jù)Blast 及PlantCARE 在線軟件分析，預(yù)測(cè)StuPPO9 基因起始密碼子上游1 661 bp 的片段為啟動(dòng)子區(qū)域。該區(qū)域中TATA-BOX 和CAAT-BOX 分別位于所選序列的1 363 和1 317 位。采用PlantCARE 在線軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)所包含的順式元件。結(jié)果表明，在StuPPO9 基因啟動(dòng)子區(qū)主要包含3 類(lèi)順式作用元件：第一類(lèi)是基礎(chǔ)表達(dá)元件包括CAAT-box 和TATA-box，說(shuō)明StuPPO9 啟動(dòng)子是一個(gè)典型的由RNA 聚合酶II結(jié)合的啟動(dòng)子；第二類(lèi)是包括已經(jīng)研究報(bào)道很多的病原誘導(dǎo)性順式作用元件，如有GT-1 等，第三類(lèi)是激素誘導(dǎo)反應(yīng)順式作用元件，如響應(yīng)乙烯的ERE 元件，ABA 誘導(dǎo)相關(guān)的ABRE，響應(yīng)MeJA 應(yīng)答相關(guān)順式作用元件CGTCA-motif、G-box 響應(yīng)auxin 應(yīng)答相關(guān)順式作用元件TGA-element，參與抗病和水楊酸通路的GT-1 motif，環(huán)境誘導(dǎo)應(yīng)答順式作用元件LTR、HSE、I-box等，由此推測(cè)，StuPPO9 啟動(dòng)子可能是一個(gè)受生物因素和非生物因素誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。

2.6 過(guò)表達(dá)StuPPO9載體的構(gòu)建和煙草植株轉(zhuǎn)化

利用StuPPO9 基因與Pcambia2301-ky 骨架重組克隆載體的大腸桿菌菌液為模板，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基因連接載體轉(zhuǎn)化菌落PCR 電泳圖（A）、StuPPO9 過(guò)表達(dá)的煙草抗性芽（B）、煙草陽(yáng)性株系的PCR 篩選（C）陽(yáng)性煙草移栽收種（D）Fig.3 PCR-electrophoresis map of gene-ligated vectortransformed colonies（A），Tobacco-resistant buds（B）Screening of positive tobacco with overexpressed StuPPO9（C）and positive tobacco transplanting（D）

通過(guò)PCR 擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3A 所示。由圖可知，在2 000 bp 處顯現(xiàn)出特異性條帶與目標(biāo)基因大小相符且為清晰、均一的電泳條帶，表明目的產(chǎn)物與克隆載體成功連接。將帶有StuPPO9 基因的pCambia2301-ky 載體，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取1 個(gè)PCR 陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒的提取。經(jīng)測(cè)序分析確認(rèn)后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染煙草外植體，誘導(dǎo)抗性芽的產(chǎn)生（圖3B），通過(guò)PCR 篩選共得到5 個(gè)陽(yáng)性株系（圖3C），并進(jìn)行移栽收種（圖3D）。

3 結(jié)論

通過(guò)檢索馬鈴薯基因組發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶基因數(shù)目多于先前報(bào)道的5～6 個(gè)成員，StuPPO5-9 是新檢索到的PPO 基因。對(duì)馬鈴薯正常植株葉片的StuPPO9 進(jìn)行分離和鑒定，得到長(zhǎng)度為1 884 bp 的序列片段，該片段中含有一段長(zhǎng)為104 bp 大小的內(nèi)含子，該基因與XM_006347021 的一致性為98.4%。與其他成員不同，它位于2 號(hào)染色體上，其啟動(dòng)子可能被生物和非生物因素誘導(dǎo)激活。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，將該基因轉(zhuǎn)入煙草中，通過(guò)PCR 檢測(cè)獲得了5 個(gè)陽(yáng)性株系。