沙鷗，劉華，鮑佳琦，崔博文，陳麗，王志，覃干景

（1.江蘇海洋大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院（連云港），江蘇連云港222005；3.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；4.江蘇深藍(lán)遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司，江蘇南通226100）

南極磷蝦（Euphausia superba），又名大磷蝦或南極大磷蝦，是一種小型的海洋浮游蝦狀甲殼類(lèi)動(dòng)物。南極磷蝦在南極生態(tài)系統(tǒng)中處于中心位置，是初級(jí)生產(chǎn)者和頂端捕食者之間的橋梁。南極磷蝦生物量約為6.5 億噸～10 億噸，是地球上最豐富的動(dòng)物物種之一，也是人類(lèi)重要的后備蛋白庫(kù)[1-2]。南極磷蝦具有高蛋白、低脂肪、含有人體所必需的全部氨基酸等特點(diǎn)，吸引了一些國(guó)家對(duì)南極磷蝦進(jìn)行規(guī)?；纳虡I(yè)捕撈，并對(duì)南極磷蝦保鮮、生物活性物質(zhì)提取、蝦油、蝦膏、蝦糜及蝦粉的加工工藝等進(jìn)行了研究[3-6]。由于南極磷蝦具有廣闊的應(yīng)用前景，我國(guó)研究者也加大了對(duì)南極磷蝦的研究[7-11]。

盡管南極磷蝦富含蛋白質(zhì)與多種微量元素，有研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)蝦中氟含量極為豐富，且蝦殼（包括甲殼和尾足）＞頭胸部＞肌肉，南極磷蝦各部分氟含量如表1所示。高氟含量不僅制約了南極磷蝦的加工與安全利用，也限制了南極磷蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[12-14]。各國(guó)研究者近年來(lái)陸續(xù)對(duì)南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)與含量進(jìn)行了研究[15-18]。由于生物體對(duì)不同形態(tài)氟化物吸收存在差異，對(duì)生物體產(chǎn)生的毒性也不盡相同，故僅檢測(cè)蝦中氟元素的總量并不能作為評(píng)價(jià)其安全性的指標(biāo)。本文系統(tǒng)闡述了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)、南極磷蝦及其產(chǎn)品中氟的前處理方式以及分析檢測(cè)方法，為南極磷蝦中的氟的賦存形態(tài)與含量檢測(cè)提供一定的科學(xué)依據(jù)與理論基礎(chǔ)，為南極磷蝦的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

表1 南極磷蝦的各部位氟的含量（干重）Table 1 Fluorine content of various parts of antarctic krill（dry weight）

1 南極磷蝦中氟的形態(tài)

化學(xué)形態(tài)分析是對(duì)元素的各種存在形式，包括游離態(tài)、共價(jià)結(jié)合態(tài)、絡(luò)合配位態(tài)、超分子結(jié)合態(tài)等進(jìn)行定性和定量的分析[21]。關(guān)于南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)，研究者有按不同的樣品前處理方式對(duì)氟進(jìn)行形態(tài)劃分，也有研究者將土壤中氟的形態(tài)分類(lèi)直接應(yīng)用于南極磷蝦中氟的形態(tài)分析研究。

根據(jù)樣品的前處理方式不同，研究者對(duì)氟的形態(tài)劃分存在多種方式。潘建明等[15]以10%KOH 甲醇溶液（甲醇∶水=9 ∶1，體積比））為提取液對(duì)南極磷蝦粉中的氟進(jìn)行提取，提取液經(jīng)加熱消解，將氯仿萃取、活性炭吸附及濾紙吸附的消解液中的氟統(tǒng)歸納為有機(jī)氟，水相中氟為無(wú)機(jī)氟，并提出南極磷蝦中有機(jī)態(tài)氟是以弱結(jié)合態(tài)的形式存在，無(wú)機(jī)態(tài)氟主要是以鈣磷無(wú)機(jī)鹽Ca5（PO4）3F 形式存在。曹明秀等[22]分別以鹽酸與水（1 ∶11，體積比）和去離子水為提取液對(duì)冷凍南極磷蝦的氟進(jìn)行浸提，把鹽酸浸提液中的氟稱(chēng)為總氟，去離子水中氟稱(chēng)為游離態(tài)氟，除游離態(tài)氟以外的統(tǒng)稱(chēng)為結(jié)合態(tài)氟。韋強(qiáng)等[23]采用去離子水對(duì)南極磷蝦粉進(jìn)行浸提，并將水提液中氟稱(chēng)為水溶性的氟。張倩[24]對(duì)南極磷蝦油進(jìn)行低溫碳化與高溫灰化樣品前處理后，將灰化殘留物中的氟稱(chēng)為總氟。李紅艷[25]對(duì)南極磷蝦酶解液進(jìn)行離心與濾膜分離預(yù)處理，濾液中的氟用0.1 mol/L 高氯酸進(jìn)行浸提，并將高氯酸浸提液中的氟稱(chēng)為總氟，具體分類(lèi)如表2 所示。

吳衛(wèi)紅等[30]采用Tisser 逐級(jí)連續(xù)提取法把土壤中的氟分為水溶態(tài)氟、可交換態(tài)氟、鐵錳結(jié)合態(tài)氟、有機(jī)態(tài)束縛氟以及殘?jiān)鼞B(tài)氟。趙曉君等[16]采用該分類(lèi)法對(duì)南極磷蝦中的氟進(jìn)行賦存形態(tài)研究（表3），并發(fā)現(xiàn)水溶態(tài)氟和可交換態(tài)氟具有較強(qiáng)的遷移和轉(zhuǎn)化特性，對(duì)生物體具有較高的有效性；該課題組采用離子選擇電極法對(duì)南極磷蝦粉中氟的賦存形態(tài)進(jìn)行定量研究[31]，發(fā)現(xiàn)人體可吸收的水溶態(tài)氟和可交換態(tài)氟占南極磷蝦體內(nèi)總氟含量的都較低，該結(jié)果為南極磷蝦的食用安全性評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。

表2 南極磷蝦氟的前處理Table 2 Pretreatment of antarctic krill fluoride

2 南極磷蝦樣品前處理方法

由于南極磷蝦中氟的存在形式多樣化，故對(duì)不同形態(tài)氟進(jìn)行測(cè)定前需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。目前文獻(xiàn)報(bào)道南極磷蝦中氟的前處理方法有灰化-蒸餾法、水浸提法、酸浸提法等。

表3 南極磷蝦氟的形態(tài)分類(lèi)[16]Table 3 Morphological classification of fluoride in antarctic krill

灰化-蒸餾法是一種較為經(jīng)典的樣品前處理方法[26]，可用于南極磷蝦及其副產(chǎn)品中總氟含量測(cè)定。南極磷蝦樣品用硝酸鎂與氫氧化鈉浸泡，浸泡液經(jīng)低溫碳化與高溫灰化后，在酸性條件下蒸餾，用氫氧化鈉溶液吸收蒸餾出的氟化物，而后對(duì)無(wú)機(jī)態(tài)氟離子進(jìn)行檢測(cè)。朱碧英等[20]采用此法對(duì)南極磷蝦全蝦中氟進(jìn)行提取，采用氟試劑比色法測(cè)得總氟含量為1 220 mg/kg，但該法操作繁瑣，敞開(kāi)式的體系容易導(dǎo)致氟損失。

水浸提法是直接采用去離子水對(duì)蝦樣品中氟進(jìn)行浸提，提取液中的氟被稱(chēng)為水溶性氟。韋強(qiáng)等[23]采用料液比 1 ∶60（g/mL），浸提溫度 65 ℃，超聲時(shí)間 40 min作為提取南極磷蝦水溶性氟的最佳條件，測(cè)得水溶性氟的含量為（435±5）mg/kg。

酸浸提法是指采用不同無(wú)機(jī)酸對(duì)蝦中的氟進(jìn)行浸提的方法，目前文獻(xiàn)報(bào)道的主要鹽酸浸提與高氯酸浸提兩種。鹽酸浸提法操作簡(jiǎn)單，直接于蝦樣品中加入1 mol/L 鹽酸進(jìn)行浸提，提取出的氟稱(chēng)為酸溶性氟，盛曉風(fēng)等[29]采用該法對(duì)蝦肉中氟進(jìn)行浸提，測(cè)得氟含量為419.8 mg/kg；高氯酸浸提與鹽酸浸提的不同之處是高氯酸浸提法不僅可以提取酸溶性氟，還可提取南極磷蝦體內(nèi)弱結(jié)合態(tài)的有機(jī)態(tài)氟[15]，李紅艷等[25]采用該法檢測(cè)南極磷蝦酶解液氯化鈣法脫氟前后氟含量，經(jīng)氯化鈣沉淀法南極磷蝦酶解液中氟離子質(zhì)量濃度由 66.6 mg/L 降至 8.3 mg/L。

3 南極磷蝦中氟的檢測(cè)技術(shù)

3.1 氟離子選擇電極法

氟離子選擇電極法的原理是氟化鑭對(duì)氟離子產(chǎn)生選擇性的對(duì)數(shù)響應(yīng)，氟電極和飽和甘汞電極在被測(cè)試液中產(chǎn)生電位差，根據(jù)能斯特方程計(jì)算出溶液中氟離子濃度[26]。氟離子選擇電極法（ion selective electrode ISE）因其選擇性好、適用范圍寬、快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[32-34]，成為目前氟離子測(cè)定的最經(jīng)典方法。

Soevilk 等[19]首次發(fā)現(xiàn)南極磷蝦富氟特性，并采用氟離子選擇電極法測(cè)得南極磷蝦總氟含量為2 400 mg/kg，此后各國(guó)學(xué)者[4，35-36]采用該法陸續(xù)開(kāi)展南極磷蝦中富氟特性的研究工作。1991 年張海生等[37]以氟離子選擇電極法測(cè)得南極磷蝦總氟含量為1 232 mg/kg，且蝦體內(nèi)氟存在形式主要以鈣磷無(wú)機(jī)鹽，而非Buchholz[38]報(bào)道的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于南極磷蝦中氟含量較高，對(duì)于國(guó)標(biāo)氟離子選擇電極法測(cè)氟需對(duì)樣品稀釋50～100 倍后方可測(cè)定，稀釋過(guò)程加大了試驗(yàn)誤差。盛曉風(fēng)等[29]對(duì)國(guó)標(biāo)法GB/T5009.18-2003《食品中氟的測(cè)定》-氟離子選擇電極法進(jìn)行改良，分別吸取低濃度（10.0 μg/mL）、中濃度（100.0 μg/mL）以及高濃度（1 000.0 μg/mL）氟標(biāo)準(zhǔn)液代替了國(guó)標(biāo)中1.0 μg/mL 氟標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍由 0.02 μg/mL～0.2 μg/mL 擴(kuò)展至0.04 μg/mL～50.0 μg/mL，減小對(duì)于南極磷蝦這種高氟產(chǎn)品檢測(cè)的誤差。趙彥玲等[28]對(duì)用國(guó)標(biāo)氟離子選擇電極法測(cè)南極磷蝦中氟含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)精密度低，因此從加大取樣量和采用標(biāo)準(zhǔn)溶液添加法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線這兩方面進(jìn)行優(yōu)化。由于南極磷蝦體內(nèi)氟含量分布不均，加大取樣量可以提高樣品的代表性，提高試驗(yàn)精密度。標(biāo)準(zhǔn)溶液添加法是連續(xù)添加200 μL 的1.0 mg/mL 氟標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別計(jì)算對(duì)應(yīng)溶液的濃度，代替國(guó)標(biāo)法分別吸取不同體積的氟標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，減小試驗(yàn)誤差、時(shí)間及試劑。

3.2 分光光度法

氟試劑比色法的原理是無(wú)機(jī)態(tài)氟離子（F-）與氟試劑（茜素氨羧絡(luò)合劑）、硝酸鑭在酸性條件下反應(yīng)生成藍(lán)色三元絡(luò)合物，氟離子濃度在一定范圍內(nèi)與該三元絡(luò)合物的吸光度成正比[26]。

1988 年朱碧英等[20]采用氟試劑比色法對(duì)南極磷蝦全蝦以及不同部位氟含量進(jìn)行測(cè)定，研究結(jié)果表明氟在南極磷蝦體內(nèi)的富集特征為：蝦殼（包括甲殼和尾足）＞頭胸部＞肌肉，測(cè)定結(jié)果與Soevilk 選用氟離子電極法基本一致。由于南極磷蝦的高氟特性，樣品經(jīng)灰化蒸餾處理后，溶液中氟濃度超出國(guó)標(biāo)GB/T5009.18-2003 檢測(cè)范圍，故趙彥玲等[28]從檢測(cè)波長(zhǎng)、溜出液稀釋倍數(shù)等多方面對(duì)進(jìn)行氟試劑比色法進(jìn)行了優(yōu)化，研究確定了檢測(cè)最佳波長(zhǎng)以及最佳稀釋倍數(shù)，從而減少試驗(yàn)誤差。

3.3 離子色譜法

離子色譜法（ion chromatography，IC）是 20 世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種新的液相色譜技術(shù)，主要用于水溶液中無(wú)機(jī)態(tài)氟離子（F-）的含量測(cè)定。該法采用陰離子交換分離柱分離氟離子與其他離子成分，以碳酸鈉一碳酸氫鈉溶液為淋洗液，硫酸溶液為再生液，用電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)F-進(jìn)行檢測(cè)[39]。該法具有準(zhǔn)確度高、選擇性好、檢出限低、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于礦石、地表水、茶葉以及牙膏等物質(zhì)中氟含量測(cè)定[40-43]。

Zhao Y L 等[44]首次采用離子色譜法對(duì)南極磷蝦中氟含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)不同浸提方式（包括水浸提、硫酸蒸餾、鹽酸浸提以及鹽酸浸提液中加入總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖液劑）對(duì)于離子色譜測(cè)定F-的影響進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，水浸提法僅能提取水溶性的F-，鹽酸浸提法中引入的大量氯離子對(duì)色譜分離柱傷害較大，鹽酸浸提法中加入總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖劑，不僅引入大量氯離子，且緩沖劑中的乙酸根離子與氟離子色譜峰重疊，而硫酸蒸餾法盡管引入了硫酸根離子，但氟離子與硫酸根離子保留時(shí)間相差較大，達(dá)到基線分離，故硫酸蒸餾更適用于南極磷蝦中氟化物的測(cè)定。Shen 等[27]采用1 mol/L 鹽酸溶液對(duì)冷凍干燥后南極磷蝦粉浸提，浸提1 h，浸提液中F-含量用離子色譜法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得蝦中可溶性氟含量為（2 122.8±64.8）mg/kg，該法與Zhao 報(bào)道的方法相比，在進(jìn)樣系統(tǒng)前增加了凈化程序（Ag+柱）以消除氯離子的干擾。

4 南極磷蝦產(chǎn)品中氟的檢測(cè)

南極磷蝦龐大的資源量是南極磷蝦商業(yè)化開(kāi)發(fā)的最大動(dòng)力，目前南極磷蝦產(chǎn)品較為普遍的產(chǎn)品存在形式有飼料級(jí)磷蝦粉、蝦油、酶解液[12-13]，因此這些產(chǎn)品中的氟含量的檢測(cè)同樣受到研究者的廣泛關(guān)注。

飼料級(jí)磷蝦粉富含氨基酸、磷脂、蝦青素、多不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料行業(yè)。Yoshitomi 等[45]采用氟試劑比色法對(duì)南極磷蝦粉喂養(yǎng)的虹鱒背部肌肉以及椎體內(nèi)氟離子含量進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明隨著南極磷蝦粉喂養(yǎng)時(shí)間增加，虹鱒脊椎體內(nèi)氟化物含量增加，并對(duì)虹鱒的生長(zhǎng)起到了抑制作用。Hansen 等[46]選擇氯化鈣作為鈣補(bǔ)充劑對(duì)降低虹鱒吸收磷蝦殼中氟化物進(jìn)行研究，通過(guò)氟離子選擇電極法對(duì)虹鱒血漿中氟含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

蝦油富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等[47]物質(zhì)，是人體自身不能合成但又不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)物，因此南極磷蝦油被廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)保健和制藥等行業(yè)。陰法文等[48]選用氯化鈣、氧化鈣、活性炭和活性粘土等作為吸收劑對(duì)南極磷蝦蝦油中的氟化物進(jìn)行去除研究，氟離子去除率通過(guò)氟離子選擇性電極法來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。郭彤等[49]以乙醇、丙酮、正己烷為提取溶劑，采用離子色譜法對(duì)不同批次提取的蝦油以及油渣中的氟化物進(jìn)行檢測(cè)分析，試驗(yàn)結(jié)果表明乙醇提取的蝦油中氟的含量最低。

南極磷蝦酶解液是指南極磷蝦在生物酶的酶解作用下形成的富含短肽和氨基酸的酶解液，具有抗氧化、清除自由基、抑制有害菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松的功能食品[50-52]。楊曉丹等[53]研究在竹炭中加Fe2（SO4）3溶液合成的改性竹炭對(duì)南極磷蝦酶解液中氟離子脫氟率，脫氟率通過(guò)氟離子選擇性電極法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。

5 結(jié)論及展望

目前，隨著對(duì)南極磷蝦資源的開(kāi)發(fā)利用，科研工作者對(duì)南極磷蝦氟的形態(tài)分析和含量測(cè)定的不斷深入研究，南極磷蝦及其產(chǎn)品中氟的檢測(cè)方法得到重視。文中提到的測(cè)定南極磷蝦及其產(chǎn)品中氟的3 種方法均存在一定的缺點(diǎn)，不同方法所得到的分析數(shù)據(jù)在可靠性和可比性等方面仍存在不少問(wèn)題，如何建立兼顧準(zhǔn)確度和靈敏度的南極磷蝦氟前處理方法和儀器檢測(cè)技術(shù)，值得進(jìn)一步研究。