高星愛 王鑫 解嬌 王飛虎 鞏彧玄 關(guān)法春 李忠和

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源與生態(tài)研究所，長春 130033）

我國東北冬季漫長，秸稈資源量大，但很難被利用，大部分秸稈被焚燒處理，不僅污染大氣環(huán)境，危害人體健康，還造成資源浪費(fèi)［1］。秸稈是一種具有多用途的可再生生物資源，只要科學(xué)合理的綜合利用，就能變廢為寶，是發(fā)展循環(huán)農(nóng)業(yè)和低碳農(nóng)業(yè)的重要實(shí)現(xiàn)途徑［2］。

近年來很多學(xué)者作了秸稈降解的研究工作，其中利用微生物處理技術(shù)降解秸稈是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［3］。秸稈是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等3 大類物質(zhì)通過共價鍵、氫鍵和蠟鍵等多種分子作用力連接組成的不溶于水的高分子化合物。由于自然條件下秸稈纖維素的結(jié)晶度和聚合度較高、環(huán)繞緊密，因此非水溶性木質(zhì)纖維素很難被水解、降解成小分子物質(zhì)［4-6］。微生物在秸稈降解中起著杻紐和關(guān)鍵作用［7］，能夠降解纖維素的微生物種類較多，細(xì)菌、放線菌、真菌乃至古菌種都具有分解秸稈能力［8］，這些菌種具體分泌秸稈分解酶包括木質(zhì)素過氧化物酶，漆酶，錳依賴過氧化物酶，纖維素酶，半纖維素酶等等降解酶類［9］。利用純菌株降解秸稈雖然具有高酶活力，但是由于秸稈組成成分的特殊性，很難被單一菌株降解，菌株對秸稈的降解效率不高［10］。復(fù)合微生物菌劑可從結(jié)構(gòu)上降低秸稈結(jié)晶度，加快秸稈降解速度，提高秸稈降解率。然而，受東北地區(qū)低溫的影響，復(fù)合微生物菌劑在秸稈降解過程中代謝緩慢，導(dǎo)致其降解速度逐漸下降，最后微生物降低或失去活性，達(dá)不到預(yù)期秸稈降解的要求，因此有必要開展在低溫條件下添加高酶活性秸稈降解復(fù)合微生物菌劑研究，旨為研究秸稈的資源化利用提供有效支持。

1 高酶活性秸稈降解微生物的研究

自然界中存在大量的纖維素降解微生物，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌。從20 世紀(jì)40 年代開始研究者們分離、篩選出降解秸稈的菌株。酶處理降解秸稈主要是利用多種纖維素水解酶類共同作用于秸稈，分解秸稈中有機(jī)質(zhì)和纖維結(jié)構(gòu)，使之轉(zhuǎn)化為CO2、水、礦物質(zhì)及熱量，最終提高秸稈中可溶性含糖量［11-12］。由于對低溫環(huán)境的要求不同，低溫微生物可分為嗜冷微生物和耐冷微生物，其最高生長溫度一般分別為20℃和40℃，最適生長溫度分別為15 和20℃左右［13-14］。根據(jù)纖維素酶功能的不同，可參與秸稈降解纖維素酶分為外切葡聚糖酶（CBH，EC 3.3.1.91），內(nèi)切葡聚糖酶（EG，EC 3.2.1.4），β-葡萄糖苷酶（BG，EC 3.2.1.21）等，這3 種酶相互作用，形成有效降解纖維素的體系［15-16］。

一般纖維素降解細(xì)菌產(chǎn)生的酶為內(nèi)切纖維素酶，內(nèi)切酶存在與細(xì)胞內(nèi)或吸附與細(xì)胞壁，需要通過細(xì)胞破碎技術(shù)，才能把纖維素酶分泌到培養(yǎng)液中［17］，所以實(shí)際上的應(yīng)用相對少一些。但是由于細(xì)菌細(xì)胞生長周期短、發(fā)酵快、秸稈降解菌株大部分為細(xì)菌，因此，高酶活性細(xì)菌普遍應(yīng)用于秸稈降解。在低溫條件下表現(xiàn)高酶活性的諸多細(xì)菌降解秸稈菌株中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L-13 在15℃下生長繁殖并分泌產(chǎn)纖維素酶［18］，節(jié)桿菌屬（Arthrobactersp.）細(xì)菌FLX-1，在10.5℃溫度條件下，產(chǎn)CMC酶活值為14.12 U/mL［19］。尚曉瑛等［20］分離、鑒定獲得的假單胞菌屬B6-15 菌株，在最適生長溫度為20℃條件下，表現(xiàn)出纖維素分解酶活為24.94 U/mL，且在10℃仍表現(xiàn)出生長良好趨勢。劉建國等［21］從土中分離得到低溫產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌，在20℃反應(yīng)條件下，發(fā)酵4 d，纖維素酶活達(dá)到38.96 U/mL。

真菌菌絲體可以穿透秸稈表層結(jié)構(gòu)，把難降解的木質(zhì)素蠟質(zhì)層破壞，產(chǎn)生的酶活力比細(xì)菌和放線菌高，具有強(qiáng)大的分解纖維素功能，因此，在秸稈降解中真菌起到主導(dǎo)性的作用［22-24］。目前獲得的真菌有草酸青霉（Penicillium oxalicum）、木霉（Trichoderma）和羊毛狀青霉（Penicillium lanosum）等。利用突變的方法獲得的綠色木霉（Trichoderma viride）CNY086 菌株，在15℃條件下，在培養(yǎng)基中填加1.2%的秸稈粉時，低溫纖維素酶活力達(dá)到108.55 U/mL［25］。劉家豪等［26］采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)，獲得紅側(cè)耳菌株CM13，利用純玉米秸稈粉培養(yǎng)基，其中測定漆酶、錳過氧化物酶、木聚糖酶和纖維素酶活力，分別達(dá)到121.23 U/L、144.11 U/L、793.38 U/L 和238.92 U/L。草酸青霉（Penicillium oxalicum）M11，在20℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)9d 時，纖維素酶活力達(dá)到33.08 U/mL，在 5-20℃ 間酶活力仍能保持90%以上［27］。在15℃條件下，霉菌屬的NLS-2，發(fā)酵7 d，其產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件為稻草粉2.5%［28］。孟建宇等［29］分離得到的屬于γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）、硬壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）以及β-變形菌綱（β-Proteobacteria）等可低溫降解纖維素的55 株菌株，在22℃條件下，纖維素酶活性均最高為58.09 U。李娜等［30］分離的青梅菌屬的低溫秸稈纖維素降解菌C1，在18℃條件下，15d內(nèi)對秸稈的降解率達(dá)55.6%，濾紙酶活和CMC 酶活分別為18.4 U/mL 和54.3 U/mL。趙旭等［3］研究獲得的青霉素Penicilliumsp. D5，在15℃條件下，木聚糖酶活力達(dá)52.7 U/mL，CMCase 酶活力達(dá)31.5 U/mL，濾紙酶活力達(dá)29.6 U/m。

許多學(xué)者的研究結(jié)果表明，利用純菌株，無法達(dá)到秸稈資源化的降解要求。利用不同微生物間的協(xié)同組合會加速纖維素分解，有效地提高對秸稈的降解能力［31-35］。但是這些單一菌株通常只具有纖維素酶、半纖維酶和木質(zhì)素酶中的一種或兩種，而復(fù)合菌株囊括以上3 種酶，可充分利用酶的相互作用發(fā)揮三者綜合效應(yīng)［36］。崔宗均等［37］篩選獲得纖維素降解復(fù)合微生物菌劑，其72h反應(yīng)后濾紙降解率達(dá)到94%。王偉東等［38］利用限制性培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)過微生物間的協(xié)同作用，構(gòu)建秸稈降解復(fù)合微生物菌群用于纖維素的快速分解糖化。鄧兵等［39］通過連續(xù)的限制性培養(yǎng)技術(shù)，得到一組高效纖維素分解復(fù)合菌系，對濾紙和玉米秸稈的降解率分別為66.5%和 66.1%，玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等3 種成分的降解率分別為17.0%、85.1%和34.4%。顧文杰等［40］通過拮抗實(shí)驗(yàn)，以哥斯達(dá)黎加鏈霉菌（Streptomyces costaricanus）、亮白曲霉（Aspergillus candidus）和黃藍(lán)狀菌（Tarlaromyces flavus）等菌屬構(gòu)建纖維素降解復(fù)合菌劑，半纖維素酶活力高達(dá)299.0 U/mL。張仲卿等［41］利用康寧木霉與黃孢原毛平革菌混合發(fā)酵玉米秸稈的效果顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵，混合真菌降解玉米秸稈纖維素和木質(zhì)素的最優(yōu)發(fā)酵條件為：菌種比例1.0∶4.1，接種量25.2%，營養(yǎng)液添加量72.2%，發(fā)酵11 d，纖維素和木質(zhì)素降解率最高分別為36.80%和28.87%。

在低溫環(huán)境條件下，很多學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，復(fù)合微生物菌劑對秸稈的降解效果優(yōu)于純菌株，在構(gòu)建低溫秸稈降解復(fù)合菌劑方面，胡海紅［42-44］等研究的秸稈降解復(fù)合菌系GF-S72，在10℃條件下，經(jīng)過15d的培養(yǎng)，秸稈降解率可達(dá)到25.6%。薩如拉等［45］采用繼代培養(yǎng)及低溫馴化方法，篩選兩種由木霉、青霉、梭菌屬（Clostridiumsp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）和草螺菌屬（Herbaspirillumsp.）菌組成的低溫降解復(fù)合菌系，在5℃培養(yǎng)15 d，玉米秸稈降解率分別達(dá)到32.21%和30.21%。微生物對木質(zhì)纖維素材料的降解會更直接反映其降解能力及實(shí)際應(yīng)用潛力。青格爾等［46-47］通過連續(xù)繼代培養(yǎng)40代構(gòu)建的GF-20 復(fù)合菌系，使秸稈降解率達(dá)到20%以上。馬志遠(yuǎn)等［48］通過對不同功效芽孢桿菌間親和性和協(xié)同性的測定，構(gòu)建出具有生防與降解秸稈雙功效的芽孢桿菌復(fù)合菌系。以上的諸多數(shù)據(jù)顯示，秸稈降解過程是連續(xù)的復(fù)雜生物化學(xué)過程，有很多不同功能的微生物，通過協(xié)同作用參與此過程，促進(jìn)玉米秸稈的分解，缺少哪一種都會影響生存共同體的生長繁殖。

2 秸稈降解微生物鑒定技術(shù)的研究

微生物進(jìn)行自身生命活動和新陳代謝時，分泌降解酶、釋放能量、同時合成細(xì)胞物質(zhì)，把纖維素大分子轉(zhuǎn)化為水溶性的單糖或雙糖等小分子物質(zhì)［49］。由于纖維素的結(jié)晶狀和不溶性剛性結(jié)構(gòu)，使得酶解效率低，利用成本高。因此，深入研究降解機(jī)理，提高纖維素酶活性，是提高降解率，秸稈資源化利用的最佳途徑［50］。

比較菌株之間的總纖維素酶活相對高低時，一般采用濾紙條崩解試驗(yàn)，以不溶性纖維素濾紙為底物，測定菌株分解纖維素的能力及其纖維素3 類酶系組分的協(xié)同作用［51-53］，同時利用操作簡便的羧甲基纖維素酶活性（內(nèi)切葡聚糖）測定法即3，5 二硝基水楊酸比色法（DNS）測定纖維素樣品酶解后產(chǎn)生的還原糖糖化能力［54-56］，這些纖維素酶活測定方法為篩選高酶活纖維素菌株方面上提供了技術(shù)支持。

某些特定的功能菌，在培養(yǎng)基上添加不同誘導(dǎo)物及營養(yǎng)物質(zhì)，配置適合的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，能觀察菌株在培養(yǎng)基上表現(xiàn)出的不同變化［57］。目前，普遍采用復(fù)篩纖維素降解菌的剛果紅染色法［58-60］，原理是纖維素分解菌種，利用水解后的多糖，同剛果紅染料反應(yīng)后呈現(xiàn)紅色透明圈，以透明圈大小初步判斷降解纖維素能力。若是培養(yǎng)基中含有兩種或多種碳源，微生物會經(jīng)歷不同的生長曲線，出現(xiàn)一個短暫的停滯期之后又出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象［61］。微生物通常首先利用比較容易降解的碳源，然后利用較難降解的碳源，利用微生物的二次生長現(xiàn)象及培養(yǎng)基定性鑒別法，在培養(yǎng)基上添加秸稈粉，延長培養(yǎng)時間，達(dá)到富集降解秸稈菌株的效果［62］。

觀察秸稈被微生物降解前后，秸稈表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化時，許多學(xué)者利用掃描電鏡進(jìn)行分析［60，63］。在鑒定菌株種屬時候，利用16S rDNA、16S rRNA 序列分子生物學(xué)技術(shù)及結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)的觀察進(jìn)行鑒定［64-66］。但是，自然界中不到1%的微生物才被傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)獲得，其余99%以上的微生物都是不可培養(yǎng)的微生物［67］。因此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者利用無需培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫構(gòu)建技術(shù)，尋找新功能基因，對微生物樣品快速檢測并進(jìn)行種類和豐度鑒定［68］。有強(qiáng)大纖維素降解能力的復(fù)合微生物菌劑，有利于解除纖維素水解產(chǎn)物的反饋抑制作用，從而提高了纖維素降解效率。根據(jù)秸稈的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選取適宜的微生物菌種進(jìn)行微生物菌劑處理秸稈利用研究［12］。鄧兵等［39］通過高通量測序方法分析了復(fù)合菌系的微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，秸稈降解菌屬主要由33.9%假單胞菌屬（Pseudom onas）、11.8%擬桿菌屬（Bacteroides）、6.9%食酸菌屬（Acidovorax）、3.8%產(chǎn)堿桿菌 屬（Alcaligenes）和1%丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等組成。宋志偉等［12］采用高通量測序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)對物料性能的影響結(jié)果表明，不同菌劑處理后物料的優(yōu)勢細(xì)菌菌群為Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）和 Chlorobacteria（綠彎菌門），優(yōu)勢真菌菌群為Ascomycota（子囊菌門）、Zygomycota（接合菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）和Unclassified-k-Fungi（未經(jīng)分類的真菌）等9 種。王志方等［69］采用高通量測序技術(shù)分析，棉秸稈在堆制過程中存在的優(yōu)勢菌屬有鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、橄欖球菌屬（Olivibacter）、假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、德沃斯氏菌屬（Devosia）和根瘤菌屬（Rhizobium）等5 種。這些功能菌的測試為降解纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)提供了氮素營養(yǎng)。部分學(xué)者通過不同菌株間的協(xié)同作用，分析了復(fù)合微生物菌系在降解纖維素過程中，微生物群落組成、相對豐度變化及多樣性演替規(guī)律。艾士奇等［70］從牛糞堆肥高溫期篩選獲得的復(fù)合菌系，在降解初期好氧菌在群落中處于數(shù)量優(yōu)勢地位，厭氧菌次之；從降解高峰期開始到降解末期，厭氧菌、兼性菌逐漸成為優(yōu)勢菌，占主導(dǎo)地位。在提高纖維素降解效率的研究中，由Unclassified bacillales、Bacillus、Petrimonas和Pusillimonas等菌種組成的復(fù)合菌系F1 和F2，作為微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化的重要物種［71］。

從外界環(huán)境中通過分離、篩選獲得秸稈降解高酶活性復(fù)合微生物菌系之后，如何更好維持微生物分泌的纖維素酶活性成為秸稈降解過程的關(guān)鍵之處。在探索秸稈纖維素分解菌保存方法對比試驗(yàn)中，李培培等［72］比較了“直接冷凍干燥”和“秸稈吸附后冷凍干燥”兩種方法的處理效果發(fā)現(xiàn)，“秸稈吸附后冷凍干燥”方法操作簡潔、能耗低，為有效的菌種保存方法。

3 低溫菌劑處理在秸稈還田中的應(yīng)用研究

秸稈中含有大量氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素和纖維物質(zhì)，秸稈還田增加土壤營養(yǎng)成分及有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤結(jié)構(gòu)，是一種肥料資源［1，73］。利用秸稈分解菌劑能加快秸稈腐解速度，豐富土壤微生物多樣性，增加農(nóng)作物產(chǎn)量，是秸稈資源化利用的有效方式［2］。選擇降解秸稈“三素”的微生物，使微生物數(shù)量增多，微生物降解木質(zhì)素的產(chǎn)物，可形成土壤腐殖質(zhì)；微生物降解纖維素產(chǎn)物的有機(jī)酸，可作為土壤中固氮菌的碳源，為纖維素分解菌的生長繁殖提供氮源［74］。利用低溫菌劑降解秸稈，進(jìn)行還田，分析玉米田土壤微生物量和土壤酶活性的影響研究中，趙偉等［75］處理低溫復(fù)合菌劑和低溫生物表面活性劑后，土壤細(xì)菌數(shù)量分別高于對照（不施菌劑）5.12%和 3.72%，其他處理均明顯低于對照，顯著提高了土壤微生物數(shù)量、土壤酶活性及微生物碳、氮含量。

秸稈堆制生物有機(jī)肥，需要微生物的馴化，加快堆肥速度，提高保氮能力，使顯著提高有機(jī)肥肥效。劉獻(xiàn)東等［76］結(jié)合微生物馴化菌釀制堆肥，專用長效保濕專用肥生產(chǎn)線為主體工藝技術(shù)及祛除生物消解、異臭味氣體的技術(shù)工藝，完成了秸稈堆制成生物有機(jī)肥。謝宇新等［77］利用低溫復(fù)合發(fā)酵劑處理低溫堆肥，在室外-20℃低溫下，牛糞接種優(yōu)化組合菌劑后物料迅速升溫，48h達(dá)55.8℃，第4天達(dá)64.9℃，高溫期維持 8-9 d，發(fā)酵周期縮短至15 d，而未加菌和加常溫發(fā)酵劑的對照則一直未進(jìn)入高溫期。玉米秸稈與牛糞混合堆肥時，秸稈吸附牛糞中的水分，使之達(dá)到堆肥適宜含水率，并且牛糞中N素能調(diào)節(jié)秸稈的C /N。張書敏等［78］研究結(jié)果表明，在8℃低溫條件下，接入低溫復(fù)合菌系，堆溫在第3 天為53. 4℃，50℃以上持續(xù)了6 d。在秸稈與畜禽糞便堆肥中，低溫纖維素分解復(fù)合菌劑起到快速發(fā)酵，縮短發(fā)酵時間，促進(jìn)在低溫條件下堆肥的起溫及加速腐熟的作用。

研究表明，不完全腐解秸稈歸還到土壤，會造成土壤與植物互相爭氮素及加速植物病害的發(fā)生［79］，因而選擇適宜的纖維素降解菌作為腐解菌劑顯得尤為重要。但在應(yīng)用和研究過程中，自然分離篩選的菌種，存在處理效果不穩(wěn)定、存活力低和優(yōu)良性狀傳代丟失等問題，部分優(yōu)質(zhì)高效菌種的研發(fā)缺少基礎(chǔ)研究成果的指導(dǎo)，導(dǎo)致效果達(dá)不到理想預(yù)期結(jié)果［80］。分析不同菌劑處理后秸稈混合物料的理化性質(zhì)、降解性能和微生物種群結(jié)構(gòu)變化，探討不同菌劑對秸稈降解性能的影響，對秸稈還田有重要意義［12］。但是隨著玉米秸稈的腐解，易于分解的底物減少，秸稈中剩下難分解的的高分子化合物，同時秸稈分解菌劑和土著微生物間競爭食物，菌劑中的微生物活性會減弱。青格爾等［81］獲得的3 種秸稈促進(jìn)分解菌劑，在10℃條件下，處理15 d，秸稈降解率分別比對照高11.09%、1.93%和4.27%；分解60 d，3 個處理分別比對照高16.38%、6.6%和6.46%，菌劑處理結(jié)果表明，菌劑的分解效果均表現(xiàn)在早期。結(jié)合以上研究成果，選擇適合的復(fù)合菌劑、降解前良好的馴化是低溫環(huán)境下提高秸稈降解效率的有效途徑。

4 展望

利用微生物處理技術(shù)降解秸稈是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，能解決秸稈產(chǎn)量大、秸稈焚燒污染環(huán)境等問題。分離、篩選高效秸稈降解微生物，研究低成本培養(yǎng)基，同時研究多種微生物協(xié)同作用的降解機(jī)理，提高秸稈纖維素分解速度和秸稈綜合利用率就成為了關(guān)鍵問題。鑒于此，需進(jìn)一步加強(qiáng)低溫秸稈降解菌劑篩選和培養(yǎng)、同時加強(qiáng)對低溫條件下嗜冷纖維素酶生化機(jī)理研究，為低溫環(huán)境下秸稈的微生物降解提供更加切實(shí)可行的理論依據(jù)和技術(shù)支持。