黃麗芳 李金芹 王曉陽 董云萍 龍宇宙 段志強 陳婷 閆林

摘要：【目的】探索低溫逆境脅迫對咖啡幼苗光合及葉綠素熒光參數(shù)的影響，為咖啡抗寒育種、引種栽培提供科學依據(jù)?！痉椒ā恳?種咖啡幼苗為材料在8℃下分別持續(xù)0、24、48、72h低溫脅迫試驗，觀察葉片的葉綠素含量、氣體交換參數(shù)及葉綠素熒光參數(shù)等指標的影響，利用隸屬函數(shù)對咖啡的抗寒性進行綜合評價。【結果】（1）大粒種和小粒種咖啡幼苗隨著低溫脅迫時間的延長，葉綠素含量先上升后下降，中粒種咖啡幼苗總體是下降趨勢。（2）3種咖啡幼苗的凈光合速率下降是由非氣孔因素導致的，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、水分利用效率和氣孔限制值等光合參數(shù)在3種咖啡幼苗低溫處理間差異不顯著，處理和對照間差異顯著。（3）在葉綠素熒光參數(shù)方面，3種咖啡幼苗的初始熒光總體水平上均有所上升，表明其Psn中心遭到低溫脅迫的損傷程度較嚴重。非光化學猝滅系數(shù)呈先上升后下降趨勢，Psn最大光化學效率、光化學猝滅系數(shù)、表觀量子傳遞速率和實際光化學量子產(chǎn)量均下降，大粒種咖啡幼苗的下降幅度較中粒種和小粒種咖啡幼苗大，表明其葉片受低溫脅迫損傷程度大。采用隸屬函數(shù)法綜合評判3種咖啡的抗寒能力，小粒種咖啡幼苗的平均隸屬度最高，表明其抗寒能力較強，中粒種和大粒種咖啡幼苗的抗寒性則較弱。【結論】綜合不同的光合及熒光指標，運用隸屬函數(shù)法能較全面地評判咖啡幼苗的抗寒性，避免了單一指標評判的片面性，其鑒定結果準確可靠。

關鍵詞：咖啡;低溫脅迫;光合作用;葉綠素熒光參數(shù);抗寒能力

中圖分類號：S 571.2

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2020） 10-1063-08

0 引言

【研究意義】咖啡屬植物約有100多種，通常所指的咖啡分為阿拉比卡咖啡（C arabica Linne）（俗稱小粒種咖啡）、甘弗拉咖啡（C.canephora Pierre）（俗稱中粒種咖啡）、利比利卡咖啡（C.libericaBull ex Hiem）（俗稱大粒種咖啡）[1-3]。中國咖啡主產(chǎn)區(qū)為海南、云南，但冬季常有低溫危害，通常限制了咖啡的開花、坐果、引起咖啡顆粒過小、不飽滿、缺陷豆比例上升，影響咖啡的產(chǎn)量和品質[4]，嚴重的可導致植株的死亡，給咖啡生產(chǎn)帶來巨大損失，制約了我國咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展。2013-2014年采收季，咖啡種植面積最大的普洱市受災2.43萬hm2，經(jīng)濟損失巨大。低溫脅迫下作物光合能力的強弱可從光合指標和葉綠素熒光參數(shù)等多方面反映[5]。光合作用是植物合成有機物和獲取能源的根本途徑，關系著植物的生長狀況、品質優(yōu)劣[6-7]。葉綠素熒光參數(shù)的變化可在一定程度上反映環(huán)境因子的變化及其對植物光合生理產(chǎn)生的影響，已被廣泛應用于植物光合機理和逆境生理等研究領域?！厩叭搜芯窟M展】在咖啡逆境生理方面，衛(wèi)新中等[8]通過外源ABA處理低溫脅迫下（4～5℃）整株和離體的小粒種咖啡葉片，表明了ABA與咖啡抗冷性密切相關。高敏等[9]研究了低溫霜凍天氣對咖啡杯品的影響，結果顯示霜凍前咖啡杯品平均得分高于霜凍后，寒害程度越重，咖啡杯品得分越低，品質下降越多。郭玉華等[10]從光合特性方面探討了夜間低溫對小粒種咖啡和大粒種咖啡的影響，闡明了小粒種咖啡相對比較耐寒。這與其較強的非輻射耗散能力、較大的胡蘿卜素/葉綠素及較強的恢復能力有關。Ramalho等[11-12]研究了冷脅迫條件下不同基因型咖啡的礦物質含量動態(tài)變化，以及不同冷脅迫時期咖啡植株的氧化應激反應等。Fortunato等[13]以小粒種和中粒種以及2份雜交種的咖啡苗為材料，研究了在冷條件下抗氧化系統(tǒng)的生物化學及分子特性，結果表明，中小粒種雜交種的冷馴化能力最強，小粒種次之。目前，對植物的抗寒性進行綜合評價常采用隸屬函數(shù)法，已在烏菜[14]、梨[15]、怪柳[16]以及彩葉藤本植物[17]上進行了研究?！颈狙芯壳腥它c】關于主栽的3種咖啡的抗寒性鑒定，低溫脅迫對咖啡幼苗光合及熒光特性的綜合評判鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用人工低溫脅迫方法對3種咖啡材料進行處理，測定光合及葉綠素熒光參數(shù)的變化，采用隸屬函數(shù)法綜合評價其抗寒性，篩選抗寒性強的咖啡種質材料，以期探明低溫脅迫下咖啡的光合特性，為咖啡抗寒選育種、引種栽培提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所，小粒種咖啡為云南省主栽品種卡蒂姆CIFC7963，中粒種咖啡為海南省主栽品種熱研4號，大粒種咖啡為大韓。培養(yǎng)到苗齡10～11月，選取健康狀況良好、長勢一致的植株轉移至人工氣候箱中進行低溫處理。每種咖啡為1個處理，每個處理3株，重復3次。

1.2 試驗方法

試驗設置8℃低溫脅迫，以Oh為對照（CK），光照強度為200 μmol.m^-2.s^-1，時間設置為12 h/12 h，相對濕度保持70%左右。分別在低溫脅迫0、24、48、72 h時進行光合和葉綠素熒光指標的測定。

葉綠素含量（ Chl）測定：應用SPAD儀進行測定，測定時選擇咖啡完全展開的功能葉片的中部，于主脈兩側共讀取6個讀數(shù)，每個處理重復測定5個葉片，并計算平均值。

采用便捷式光合系統(tǒng)分析儀LI-6400（ LI-COR，USA）測定各咖啡幼苗的第三或第四片完全展開葉片的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（ Ci）和氣孔導度（Gs）等指標，并計算水分利用效率（ WUE）和氣孔限制值（Ls），WUE=Pn/Tr，Ls=1-Ci/Ca。測定條件：溫度為測定時幼苗所處溫度，光強度1 000 μmol.m^-2s^-1，流速為500 μmol.s^-1，CO2氣體由小鋼瓶提供，控制濃度為400 μmol.mol^-1，每個處理分別測定3次。

葉綠素熒光參數(shù)：采用熒光葉室6400-40測定不同梯度處理的咖啡幼苗葉綠素熒光參數(shù)。測定光化光強度為188 μmol.m^-2s^-1，強飽和脈沖光強度為2 400 μmol.m^-2s^-1，脈沖光時間為0.8 s。測定前先將葉片暗適應20～30 min，后測定初始熒光（Fo）、PSII最大光化學效率（FJFm）;光適應下PSII實際光化學量子產(chǎn)量（φPSII）、非光化學猝滅系數(shù)（qN）、光化學猝滅系數(shù)（ qP）和電子傳遞速率（ETR），每個處理分別測定3次。

咖啡耐寒性綜合評價參考劉杜玲等[18]的方法，抗寒系數(shù)=（低溫脅迫后72 h指標測定值/對照指標測定值）×100%。

采用模糊綜合評判方法中的隸屬度公式，綜合評價不同咖啡的耐寒性。參照陳明輝等[19]的方法，計算隸屬函數(shù)值和平均隸屬度。與耐寒性呈正相關的指標用公式（1）計算，與耐寒性呈負相關指標的用反隸屬函數(shù)公式（2）計算：

在所有參試材料中的最小值和最大值。隸屬函數(shù)平均值越大，則耐寒性越強。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復的均值，采用Excel 2007和SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用LSD檢驗（a=0.05）進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1低溫脅迫對咖啡葉片葉綠素含量和光合參數(shù)的影響

由表1可知，大粒種和小粒種咖啡隨著低溫脅迫時間的延長，葉綠素（ Chl）含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;大粒種和中粒種咖啡Chl含量在各處理間的差異不顯著（P>0.05），小粒種咖啡各處理間差異達顯著冰平（P<0.05），48h比CK上升了28.72%。不同咖啡品種在8℃低溫脅迫過程中Chl含量的變化程度不同。

3個品種在低溫脅迫過程中，處理組的光合速率（ Pn）與CK的差異達到顯著水平，大粒種和中粒種咖啡處理間差異不顯著，小粒種咖啡處理72 h時與CK和24 h處理差異達顯著水平（P<0.05），比CK下降了97.54%;3種咖啡的Tr、WUE、Ls和Gs幾乎都呈現(xiàn)下降趨勢，大粒種咖啡的Tr和WUE各處理間差異不顯著（P>0.05），中粒種和小粒種咖啡的Tr含量和WUE含量均在72 h時相對顯著于CK處理，小粒種咖啡的Tr和WUE降幅最大，比CK下降了82.33%和86.60%;3種咖啡的Ls在低溫脅迫3個處理間的差異均不顯著，只有中粒種咖啡的CK與各處理達到顯著差異水平（P<0.05）;大粒種咖啡的Gs含量72 h時降到最小值，與CK相比，下降了80%。3種咖啡的胞間C02濃度（Ci）均呈上升的趨勢，低溫處理72 h與CK差異達顯著水平（P<0.05）。

2.2 低溫脅迫對咖啡葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表2可知，在低溫脅迫過程中，大粒、中粒和小粒種咖啡的初始熒光（Fo）含量呈先上升后下降的趨勢，在48 h時達到最大值，分別比對照上升了19.59%、17.03%和8.26%，且Fo均未達到顯著狀態(tài)（P<0.05）。各供試材料在低溫脅迫后的FJFm、光化學猝滅系數(shù)（qP）、表觀量子傳遞速率（ETR）和PSII實際光化學量子產(chǎn)量（φPSII）均下降，且隨脅迫時間的延長，下降幅度均增大，大粒種4個指標的降幅都為最大值，達到31.08%、88.68%、85.77%和88.24%。3種咖啡低溫處理24、48、72 h的qP、ETR和φPSII與CK差異達到顯著水平（P<0.05），小粒種咖啡的Fv/Fm在低溫脅迫72 h時與前面3個處理的差異迭到顯著水平。大粒種和小粒種咖啡的非光化學猝滅系數(shù)（qN）表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，小粒種咖啡處理24 h和48 h與CK相比達到顯著水平（P<0.05），72h與CK差異不顯著。

2.3不同種咖啡各單項指標的抗寒系數(shù)

由表3各單項指標的抗寒系數(shù)可看出，不同咖啡幼苗抗寒系數(shù)值所反映的抗寒性不同。3種咖啡幼苗經(jīng)過8℃低溫脅迫72 h時，與CK組相比，各指標在低溫脅迫后均有不同程度的變化，大粒種咖啡的Chl、Pn和Ls抗寒系數(shù)為最大值，中粒種咖啡的Tr、Ci、WUE、 Gs、 qP、qN、 ETR、Fo、Fv/Fm和φPSII抗寒系數(shù)為最大值，小粒種咖啡的Pn、Tr、Ci、WUE、Gs和Fo抗寒系數(shù)為最小值，說明同一種質各指標的抗寒系數(shù)存在較大差異，同一指標在不同種質間也存在明顯差異，反映出不同種質對低溫脅迫的敏感程度不相同。

2.4 各抗寒指標間的相關性分析

表4的相關分析表明，Chl含量與qP、qN、φPSII呈極顯著正相關（P<0.01），與FJFm呈顯著正相關（P<0.05）;Pn與Tr、WUE、Ls、Gs、qP、ETR、Fv/Fm呈極顯著正相關（P<0.01）;T與Gs、qP、ETR、Fv/Fm呈極顯著正相關（P< 0.01）;Ci與Pn、WUE、Ls、qP、ETR、FJFm呈極顯著負相關（P<0.01）;WUE與Ls、qP、ETR、Fv/Fm，Ls與qP、ETR、FJFm呈極顯著正相關（P

2.5 不同種咖啡單項指標主成分分析

主成分分析結果表明（表5），各因子特征值中，前3個因子的貢獻率分別為48.23%、20.37%和16.23%，累積貢獻率達84.83%。因此，抽取前3個因子，可將原來各單項指標轉換成3個綜合指標（分別用Al、A2、A3表示）。Al在Pn、qP、ETR和Fv/Fm上有較高載荷量，A2在Chl、qN和φPSII上有較高載荷量，A3在Ci和Gs上有較高載荷量。

2.6 不同種咖啡抗寒性的綜合評判

由單一指標評價植物的抗寒性具有片面性，因此，用多個指標綜合評價咖啡的抗寒性才較為可靠。不同種咖啡抗寒性綜合評判結果表明：Ci與其他指標呈負相關，起負面作用，其值越高，抗寒性越低，利用反隸屬函數(shù)，而其他指標對咖啡抗寒起正向作用，采用隸屬函數(shù)法，咖啡品種抗寒性平均隸屬函數(shù)綜合評價表現(xiàn)為小粒種>中粒種>大粒種。小粒種咖啡的平均隸屬函數(shù)值最高，為0.16，耐寒性最強，中粒種和大粒種咖啡的平均隸屬度差異不大，耐寒性較弱，分別是0.11和0.10（表6）。

3 討論與結論

3.1 低溫脅迫與葉片相對葉綠素含量

葉綠素含量的多少與植物葉片光合作用能力強弱有直接關系，葉綠素含量越高，代表植物捕獲光能的能力越強。葉綠素捕獲光能的能力還受溫度的影響[20]，溫度影響植物體代謝進程，從而影響合成Chl的原料供給，造成Chl含量升高或者降低[21]。本研究低溫脅迫期間中粒種咖啡葉片的Chl含量總體是下降趨勢，低溫導致葉綠素合成過程受到阻礙如光合酶的活性受到抑制，或是葉綠體超微結構被破壞，使植物葉片內(nèi)Chl含量降低[22-23]。而大粒種和小粒種葉片的Chl含量呈現(xiàn)先上升后下降，可能是由于在適當?shù)牡蜏丨h(huán)境下咖啡通過自身調節(jié)適應溫度的變化，誘導咖啡光合色素含量升高，但當?shù)蜏貢r間延長，超出其承受范圍，導致光合色素分解，葉綠素含量降低，這與大葉冬青[24]、草地早熟禾[25]、紫色小白菜[7]對低溫的響應一致。

3.2 咖啡幼苗抗寒性與光合參數(shù)

低溫直接影響植物光合器官結構和能量生成、利用能力，間接影響光合作用，光合作用的強弱通過光合參數(shù)反映[5，26]。小粒種咖啡幼苗在正常處理以及低溫脅迫48 h時Pn均最大，說明小粒種咖啡幼苗的光合能力較強。本研究隨著低溫脅迫時間的延長，3種咖啡幼苗的Pn、Tr和Gs呈不同程度的下降趨勢，而Ci升高，表明Pn下降是因為葉綠素、光化學活性、無機磷和RuBP羧化的限制，導致細胞間隙CO，積累，由非氣孔因素導致的[27-28]。Tr、Gs、WUE和Ls都大幅下降，表明低溫脅迫下植物葉片氣孔開張度變小，導致植株WUE和Ls也隨之減少，從而減小了蒸騰拉力。Pn、Tr、WUE、Gs和Ls等光合參數(shù)大多在3種低溫處理間差異不顯著，處理和對照間差異顯著，也許是由于咖啡是熱帶作物，突然遭到低溫脅迫，光合系統(tǒng)受損，各光合參數(shù)顯著降低，而隨著脅迫時間的延長，植株逐漸適應低溫環(huán)境，光合參數(shù)值下降趨勢變緩。

3.3 咖啡幼苗抗寒性與葉綠素熒光參數(shù)

葉綠素熒光分析技術在植物應答逆境脅迫過程中被廣泛用于抗性種質的評價和抗性機理研究，有助于探明光合機構受逆境脅迫傷害的部位和程度[29]。Fo是PSn反應中心完全開放狀態(tài)時的熒光強度[19]，低溫條件下，PSII反應中心遭受類囊體膜損傷或者不易逆轉的破壞等，都會導致Fo上升，受損程度與Fo增加量成正比[30]。本研究中，3種咖啡幼苗的F?？傮w水平上均有所上升，小粒種咖啡幼苗的幅度較小，大粒種咖啡和中粒種咖啡幼苗的上升幅度較大，表明其PSII中心遭到低溫脅迫的損傷程度較嚴重。qN反映了光系統(tǒng)Ⅱ反應中心非輻射能量耗散能力的大小，3種咖啡幼苗在低溫脅迫24 h時qN均呈現(xiàn)上升趨勢，暗示植物已通過啟動光保護反應來避免過量光傷害，隨低溫脅迫時間的延長，qN含量又有所降低，PSII反應中心開放度減小，光合電子傳遞活性減弱，與陳梅[31]、周福平[32]的試驗結果一致。FJFm是植物抗寒性的主要指標，在多種植物研究中發(fā)現(xiàn)抗寒力弱的品種（系）比抗寒力強的下降更快速[33]。φPSII、qP和ETR顯著下降說明低溫減弱QA的氧化能力及Psn的電子傳遞能力，導致碳同化降低，光合系統(tǒng)受損[6]。大粒種咖啡幼苗的Fv/Fm、qP、ETR和φPSn下降幅度都最大，表明其葉片受低溫脅迫損傷程度越大，國內(nèi)學者對不結球白菜和甜瓜的研究表明，耐寒性弱的品種（系）光化學效率和有效性電子傳遞能力比不耐寒的要低，光合受抑程度較重，本研究結果也證實了這一點[34-35]。

綜上所述，8℃低溫脅迫可嚴重抑制咖啡幼苗的光合作用和生長，PSII反應中心受到損傷，前期咖啡幼苗可以通過啟動光保護反應及減小葉片氣孔開張度及蒸騰拉力來避免過量的光傷害，但隨著脅迫時間的延長，光合電子傳遞活性減弱，損傷程度加劇。采用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對各抗寒性不同的光合及熒光指標進行綜合分析發(fā)現(xiàn)，3種咖啡幼苗的抗寒能力由強到弱依次為：小粒種咖啡>中粒種咖啡>大粒種咖啡，中粒種和大粒種咖啡幼苗耐寒性差異并不大，這和生產(chǎn)實踐中的結果較一致。在今后的工作中，還應從與耐寒性相關的特異基因與蛋白質表達等方面開展更深入的研究，從實際生產(chǎn)和理論基礎兩個層面系統(tǒng)解釋與完善咖啡的抗寒機理。

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作者簡介：黃麗芳（1985-），女，碩士，助理研究員，研究方向：咖啡遺傳育種（E-mail： hlf032@163.com）

通信作者：閆林（1980-），女，博士，研究員，研究方向：咖啡種質資源與遺傳育種（E-mail： yanlin2575@163.com）