吳亞鋒 王楠楠 王晶晶 方蘋 姚俊宇 劉肖漢

摘要：為調(diào)查江蘇省水生動物感染氣單胞菌（Aeromonas）的流行規(guī)律和發(fā)病特征，本研究于2017年和2018年在全省范圍內(nèi)采集魚、蝦、蟹等發(fā)病樣品1 375批次，并進行細菌分離鑒定和體外藥敏試驗。結(jié)果表明，共分離得到氣單胞菌1 364株，其中以嗜水氣單胞菌最多，占67.23%。最小抑菌濃度（MIC）試驗結(jié)果表明，氣單胞菌分離株對8種抗菌素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中喹諾酮類藥物、氟苯尼考對分離株的MIC最低，均為0.39 μg/mL。從耐藥性角度分析，氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率最低，為8.58%。與2017年相比，2018年氣單胞菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素等6種抗菌素的耐藥率均有所提高。綜上，作為治療水生動物細菌性疾病的常用藥物，恩諾沙星和氟苯尼考目前仍有良好的效果，但須要警惕細菌耐藥性的進一步提高。

關(guān)鍵詞：江蘇省;水生動物;氣單胞菌;分離鑒定;抗菌素;耐藥性

中圖分類號： S941.42 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0156-07

氣單胞菌（Aeromonas）廣泛分布于池塘、水庫等不同的水體環(huán)境中[1-2]，在健康人體和魚類體內(nèi)也有分布[3]，為條件致病菌，在應(yīng)激條件（如飼料不佳、溶解氧含量較低、氣候劇變等）下，能引起大宗淡水魚、蝦蟹類等水生動物發(fā)生細菌性出血性敗血癥[4]，造成巨大的經(jīng)濟損失。近年來，因為一直無法真正做到有針對性地科學用藥，在生產(chǎn)實踐中則反映出在疾病防治過程中的亂用、濫用藥物現(xiàn)象比較普遍，極易產(chǎn)生耐藥菌株，加劇了氣單胞菌感染的防治難度[5]。

據(jù)統(tǒng)計，2017年江蘇省水產(chǎn)養(yǎng)殖面積為 4.21萬hm2，水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量為520.1萬t，漁業(yè)產(chǎn)值為1 730億元，占農(nóng)業(yè)經(jīng)濟總產(chǎn)值的22.51%。2018年江蘇省漁業(yè)經(jīng)濟總產(chǎn)值達到3 386億元，同比增長5.1%，水產(chǎn)養(yǎng)殖在農(nóng)業(yè)中的地位和作用凸顯[6-7]。江蘇省2017年因水產(chǎn)病害造成的直接經(jīng)濟損失高達47 312萬元，其中細菌性疾病發(fā)生比率占50.51%。為進一步提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟產(chǎn)值和指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學用藥，十分有必要進行細菌性疾病的監(jiān)測工作。

為探究江蘇省水生動物氣單胞菌感染的流行規(guī)律及發(fā)病特征，本研究于2017年、2018年采集了江蘇省主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)常見養(yǎng)殖品種樣品，分離鑒定得到氣單胞菌，并進行藥物感受性分析，以監(jiān)測其變化趨勢，同時繪制分離株對常見藥物的耐藥譜，以期為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶規(guī)范用藥提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集 根據(jù)江蘇省各地水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展情況和養(yǎng)殖規(guī)模，于2017年、2018年采集水生動物發(fā)病樣品。樣本采集地區(qū)信息見表1。樣品來源涵蓋大宗淡水魚類如青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊等，特色養(yǎng)殖品種如凡納濱對蝦、暗紋東方鲀、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹、脊尾白蝦等。采樣部位包括肝、脾、腎、鰓、腹水等。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA marker、核酸染料、瓊脂糖、瓊脂粉等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;2×PCR Mix液，購自寶生物工程（大連）有限公司;腦心浸液肉湯（BHI），購自英國Oxoid公司;革蘭氏染色液、細菌生化微量鑒定管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司;硫酸新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、甲砜霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、紅霉素、鹽酸土霉素和鹽酸多西環(huán)素等8種抗菌素藥物標準品均購自南京鼎國生物技術(shù)有限公司。其他相關(guān)試劑均購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化、革蘭氏染色和生化鑒定 氣單胞菌的分離純化按照曹青等的方法[8]進行，革蘭氏染色及各項生化指標的檢測和結(jié)果判定參照文獻[9]進行。

1.2.2 16S rRNA和gyrB基因PCR擴增及序列分析 采用16S rRNA和氣單胞菌屬看家基因DNA促旋酶B亞單位合成基因（gyrB）進行分子生物學鑒定，引物序列見表2。細菌基因組的DNA提取、PCR擴增和序列分析按照曹青等的方法[8]進行，菌株系統(tǒng)發(fā)育樹用MEGA 5進行制作。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 根據(jù)陳昌福等依據(jù)日本化學療法學會改良的方法[10]進行細菌最小抑菌濃度的測定和判讀。根據(jù)美國國家臨床實驗室標準委員會（clinical and laboratory standards institute，簡稱CLSI）頒布的判斷標準和趙姝等的方法[11]，進行藥物的敏感性結(jié)果判定。判定標準如表3所示，并以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣單胞菌分離鑒定結(jié)果

在BHI固體培養(yǎng)基上，氣單胞菌分離株的菌落呈圓形、中央微凸、表面光滑、淡黃色，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌。部分氣單胞菌生化試驗結(jié)果見表4，對分離菌進行16S rRNA擴增，將條帶大小跟預(yù)期目的條帶大小一致（圖1-A）的PCR產(chǎn)物送樣測序，利用Blast比對確定到種。確定為氣單胞菌的菌株，再進行g(shù)yrB基因PCR檢測，將條帶大小為 1 100 bp 的樣品（圖1-B）進行測序分析和遺傳演化分析（圖2）。

2.2 氣單胞菌分離株種類及組成

2017年和2018年從發(fā)病水產(chǎn)樣品中共分離得到氣單胞菌1 364株，涉及11個種（表5），其中嗜水氣單胞菌占大多數(shù)，為67.23%，在全省主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)都能分離到;其次是維氏氣單胞菌和溫和氣單胞菌，分別占17.45%、12.02%;此外還分離到A. culicicola、舒氏氣單胞菌和異嗜糖氣單胞菌等屬內(nèi)不常見菌種，表明氣單胞菌在江蘇省水生環(huán)境中分布廣泛且種類較多。

2.3 菌株來源情況

對氣單胞菌分離株來源情況進行分析，由表6可知，鯽源株最多，占38.56%，其次為草魚源和中華絨螯蟹源分離株，分別占22.36%、11.58%。從以青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊為主的大宗淡水魚中共分離到各種氣單胞菌1 018株，占總數(shù)的74.63%。

2.4 氣單胞菌分離株對抗菌藥物的感受性

2.4.1 抗菌藥物對氣單胞菌分離株的MIC 2017年、2018年共分離得到氣單胞菌屬細菌1 364株，抗菌藥物對其的MIC如表7所示。喹諾酮類藥物、氟苯尼考對氣單胞菌分離株的MIC最低，均為 0.39 μg/mL，其次為硫酸新霉素、鹽酸土霉素、鹽酸多西環(huán)素;紅霉素對氣單胞菌分離株的MIC最高，為50.00 μg/mL。

2.4.2 氣單胞菌對抗菌藥物感受性的變化 根據(jù)抗菌藥物對氣單胞菌分離株的MIC，判定菌株對不同藥物的感受性。如圖3所示，氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率最低，為8.58%，其次為鹽酸多西環(huán)素;除紅霉素外，分離株對甲砜霉素的耐藥率最高，為29.84%。與2017年相比（表8），2018年分離的氣單胞菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素等6種抗菌素的耐藥率都有所提高，最高提高了17.91%，最低提高1.56%;而對恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素等5種抗菌素的敏感率下降，其中對氟苯尼考的敏感率下降了10.63%。

2.4.3 抗菌藥物對不同種氣單胞菌分離株的MIC 對抗菌藥物對不同種氣單胞菌分離株的MIC進行比較。如表9所示，8種抗菌素對維氏氣單胞菌的MIC均不低于對嗜水氣單胞菌和其他幾種氣單胞菌的MIC，其中恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星對它的MIC均為嗜水氣單胞菌的7.8倍;而8種抗菌素對嗜水氣單胞菌的MIC均為最低值，但與溫和氣單胞菌的相差不大。這表明維氏氣單胞菌在氣單胞菌屬中耐藥性較強，具有潛在的威脅，也與近期維氏氣單胞菌引起發(fā)病的報道越來越多有一定相關(guān)性[12]。

2.5 不同地區(qū)鯽源氣單胞菌分離株對恩諾沙星和氟苯尼考的感受性

恩諾沙星和氟苯尼考在江蘇水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用較多。為探究地域差異對恩諾沙星和氟苯尼考耐藥性的影響，以樣本量較大的鯽為研究對象，比較江蘇省13個地級市鯽源氣單胞菌分離株對這2種抗菌素的耐藥性。

由圖4可知，揚州地區(qū)氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率遠遠高于其他地級市，達到62.5%;其次是徐州市，為25.0%;宿遷、南通、無錫、南京、蘇州、 連云港等市的最低，均為0。南京和鎮(zhèn)江地區(qū)氣單胞菌分離株對氟苯尼考的耐藥率較高，分別為74.19%、71.43%;其次為徐州市，為50.0%;無錫、蘇州、揚州、淮安、連云港等市的最低，均為0。鑒于某些地級市鯽源氣單胞菌菌株數(shù)略少，地區(qū)耐藥性趨勢的準確性還有待持續(xù)監(jiān)測。

揚州地區(qū)氣單胞菌分離株對恩諾沙星最耐藥，但對氟苯尼考較敏感;而南京地區(qū)氣單胞菌分離株對氟苯尼考較耐藥，但對恩諾沙星較敏感。這表明不同地區(qū)的養(yǎng)殖用藥習慣對病原菌分離株的耐藥性有較大影響。

3 討論

氣單胞菌在江蘇省水生環(huán)境中分布廣泛且種類較多，本研究在江蘇省各地采集樣本1 375批次，分離得到氣單胞菌1 364株。丁正鋒等對江蘇省水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病原菌開展監(jiān)測工作，通過生化鑒定、分子生物學鑒定和高通量測序等方法，均發(fā)現(xiàn)在發(fā)病樣品分離菌中以氣單胞菌屬細菌最多[13-15]。本研究共鑒定出11種氣單胞菌，其中嗜水氣單胞菌在江蘇省主要養(yǎng)殖區(qū)的水生環(huán)境中最常分離到，占總數(shù)的67.23%，其次是維氏氣單胞菌，這與Figueras等的研究結(jié)果[3，16]一致。崔丙健等發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌三者的豐度相差不大[15];而Ghenghesh等則認為在水生環(huán)境中溫和氣單胞菌在氣單胞菌中占很大的比例[17];Li等檢測了閩江流域中氣單胞菌的分布，發(fā)現(xiàn)豚鼠氣單胞菌和水族箱氣單胞菌占很大的比例，而維氏氣單胞菌幾乎沒有分離到[18]。造成這些差異的原因可能有地域和樣品來源的不同以及細菌鑒定方法的不同等。

抗菌藥物對分離株的MIC測定結(jié)果表明，所得到的氣單胞菌分離株對8種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。其中，喹諾酮類藥物、氟苯尼考對分離株的MIC最低，均為0.39 μg/mL。分離株對恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星最敏感，但同時對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素等6種抗菌素的耐藥率持續(xù)上升，這提醒我們須要注意抗生素的合理使用，以防止耐藥性的進一步上升。本研究中氣單胞菌分離株對鹽酸環(huán)丙沙星的敏感率為76.96%，而汪永祿等對馬鞍山地區(qū)66株環(huán)境源氣單胞菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)病原菌對環(huán)丙沙星的敏感率達100%[19];肖丹等研究發(fā)現(xiàn)94%以上的菌株對新霉素敏感[20]，而黃玉萍等發(fā)現(xiàn)復(fù)合水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中57株氣單胞菌對新霉素的耐藥率達33.33%[21]。不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖品種、不同用藥習慣，對水生動物病原菌的耐藥性均有一定的影響。后續(xù)將開展耐藥基因的檢測，以探討氣單胞菌基因型與耐藥性的相關(guān)性。

作為相關(guān)檢驗領(lǐng)域的“金標準”，CLSI初期公布的判定標準主要針對人醫(yī)以及人類抗生素。隨后，該機構(gòu)在2013年發(fā)布了獸醫(yī)藥物敏感性試驗標準。該標準與歐盟藥敏試驗標準委員會（EUCAST）公布的標準一起成為目前我國獸用抗菌藥耐藥判定標準的主要依據(jù)。然而數(shù)據(jù)并不完整，尤其是針對對象不同、藥物種類與判別依據(jù)更是存在一定差異[22]。本研究中紅霉素的判定折點標準是參考其他菌株進行的，恩諾沙星的標準也是參考其他喹諾酮類藥物。因此，目前仍沒有符合我國國情的、符合漁業(yè)不同養(yǎng)殖品種的耐藥判定標準，這給水產(chǎn)藥物的科學使用帶來一定的困擾。本研究通過對江蘇省水生動物氣單胞菌分離株開展耐藥性監(jiān)測，了解了氣單胞菌耐藥情況，以期為制定耐藥判定標準和指導(dǎo)水產(chǎn)科學用藥提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]任亞林，李 耘，韓 剛，等. 水產(chǎn)品中嗜水氣單胞菌耐藥性研究進展[J]. 生物工程學報，2019，35（5）：759-765.

[2]Janda J M，Abbott S L. The genus Aeromonas：taxonomy，pathogenicity，and infection[J]. Clinical Microbiology Reviews，2010，23（1）：35-73.

[3]Figueras M J. Clinical relevance of Aeromonas sM503[J]. Reviews in Medical Microbiology，2005，16（4）：145-153.

[4]Beaz-Hidalgo R，F(xiàn)igueras M J. Aeromonas spp. whole genomes and virulence factors implicated in fish disease[J]. Journal of Fish Diseases，2013，36（4）：371-388.

[5]馮東岳，王玉堂，汪 勁. 我國水生動物源細菌耐藥性監(jiān)測開展情況及有關(guān)建議[J]. 中國水產(chǎn)，2017（5）：34-37.

[6]王晶晶，方 蘋，陳 靜，等. 2017年江蘇省水產(chǎn)養(yǎng)殖病情監(jiān)測分析[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2018，39（8）：46-52.

[7]農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局. 2019中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2020.

[8]曹 青，張向陽，龐茂達，等. 南京地區(qū)某漁場嗜水氣單胞菌流行菌株的鑒定及分子分型[J]. 水產(chǎn)學報，2017，41（1）：134-141.

[9]Buchanan R E，Gibbons N E. Berge's manual of determinative bacteriology[M]. 8th ed. Beijing：Science Press，1984.

[10]陳昌福，陳 輝，馮東岳，等. 溫和氣單胞菌對氟苯尼考的耐藥性獲得和消失速率[J]. 當代水產(chǎn)，2015，40（8）：90-91.

[11]趙 姝，姜 蘭，周俊芳，等. 水生動物源嗜芳香環(huán)弧菌的鑒定及耐藥性分析[J]. 水產(chǎn)學報，2019，43（5）：1369-1377.

[12]康元環(huán)，張冬星，楊濱僮，等. 維氏氣單胞菌最新研究進展[J]. 中國人獸共患病學報，2018，34（5）：452-459，465.

[13]丁正峰，薛 暉，王曉豐，等. 江蘇主要水產(chǎn)病原菌耐藥譜系監(jiān)測[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39（2）：344-347.

[14]Hu M，Wang N，Pan Z H，et al. Identity and virulence properties of Aeromonas isolates from diseased fish，healthy controls and water environment in China[J]. Letters in Applied Microbiology，2012，55（3）：224-233.

[15]崔丙健，高天明，陳 琳. 異育銀鯽養(yǎng)殖環(huán)境典型病原微生物檢測和細菌群落解析[J]. 微生物學通報，2019，46（12）：3363-3377.

[16]Ottaviani D，Parlani C，Citterio B，et al. Putative virulence properties of Aeromonas strains isolated from food，environmental and clinical sources in Italy：a comparative study[J]. International Journal of Food Microbiology，2011，144（3）：538-545.

[17]Ghenghesh K S，El-Ghodban A，Dkakni R，et al. Prevalence，species differentiation，haemolytic activity，and antibiotic susceptibility of aeromonads in untreated well water[J]. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz，2001，96（2）：169-173.

[18]Li F，Wang W，Zhu Z，et al. Distribution，virulence-associated genes and antimicrobial resistance of Aeromonas isolates from diarrheal patients and water，China[J]. The Journal of Infection，2015，70（6）：600-608.

[19]汪永祿，黃振洲，王 利，等. 2017年安徽省馬鞍山市環(huán)境來源氣單胞菌的分子特征和耐藥分析[J]. 疾病監(jiān)測，2019，34（9）：805-810.

[20]肖 丹，曹海鵬，胡 鯤，等. 淡水養(yǎng)殖動物致病性嗜水氣單胞菌ERIC-PCR分型與耐藥性[J]. 中國水產(chǎn)科學，2011，18（5）：1092-1099.

[21]黃玉萍，鄧玉婷，姜 蘭，等. 復(fù)合水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中氣單胞菌耐藥性及其同源性分析[J]. 中國水產(chǎn)科學，2014，21（4）：777-785.

[22]房詩薇，黃玲利，謝書宇，等. 獸用抗菌藥耐藥判定標準的研究進展[J]. 中國抗生素雜志，2019，44（6）：667-673.陳文杰，杭柏林，劉保國，等. 鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性與抗原性分析及細胞表位預(yù)測[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（24）：163-167.