陳燕萍　劉欣　肖榮鳳　朱育菁　林永勝　劉波

摘要：【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.momodicae）侵染引起的一種重要土傳病害。為有效防控該病害，對其病原菌進行綠色熒光蛋白基兇（gfp）標記，為研究病原菌在苦瓜植株體內(nèi)的侵染特性提供可視化跟蹤檢測手段?！痉椒ā坎捎棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對苦瓜枯萎病原菌強致病性野生型菌株FJAT-3018進行綠色熒光蛋白基兇（gfp）標記，通過對轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)觀察、生長速率和致病性測定，篩選出遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子?！窘Y(jié)果】野生型菌株FJAT-3018的轉(zhuǎn)化效率約為14.5個轉(zhuǎn)化子/106個孢子。經(jīng)10次繼代培養(yǎng)，篩選獲得的轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)、生長速率和致病性方面與野生型菌株FJAT-3018無明顯差異，gfp基兇在轉(zhuǎn)化子的菌絲體和分生孢子中均能強表達;通過激光共聚焦顯微鏡掃描跟蹤發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子能夠在苦瓜植株根部和莖部侵染與定殖。【結(jié)論】綠色熒光蛋白基因已成功轉(zhuǎn)入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性且致病力不受影響。

關(guān)鍵詞：苦瓜;枯萎病;綠色熒光蛋白;基因標記

中圖分類號：S436.8

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）11-1228-06

0引言

【研究意義】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.Momodicae）侵染引起的一種毀滅性土傳病害，該病害在苦瓜整個生育期均可發(fā)生，并導(dǎo)致植株萎蔫死亡，造成產(chǎn)量損失，嚴重制約了苦瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。為有效防控該病害，亟需了解該病原菌對苦瓜的侵染特性。因此，建立一種可視化的跟蹤標記手段，有助于深入研究該病原菌的侵染過程和指導(dǎo)該病害防控。【前人研究進展】綠色熒光蛋白標記基因（gfp）可為研究病原菌在植株體內(nèi)的侵染蔓延提供可視化跟蹤技術(shù)[3]。它具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、直觀、操作方便和不需要添加外源底物就可以在活細胞中直接檢測等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于真菌分子生物學(xué)研究[4-5]。適用于鐮刀菌屬真菌的gfp基因轉(zhuǎn)化方法有多種，如PEG介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法等[6-8]。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是直接以真菌孢子或菌絲為受體，較PEG介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法的操作更簡單，可減少轉(zhuǎn)化過程中其他因素的影響，且轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性也更高[9]。【本研究切入點】目前，國內(nèi)外學(xué)者已利用gfp基因成功標記了番茄、香蕉、甜瓜和玉米等寄主作物尖孢鐮刀菌[10-14]，但未見苦瓜枯萎病原菌的gfp基因標記的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為有效防控該病害，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對苦瓜枯萎病原菌強致病性野生型菌株FJAT-3018進行綠色熒光蛋白基因（gfp）標記，并比較轉(zhuǎn)化前后菌株的菌落形態(tài)、生長速率和致病性差異，篩選m遺傳穩(wěn)定標記的轉(zhuǎn)化子，有助于通過可視化跟蹤觀察深入研究該病原菌的侵染過程和指導(dǎo)該病害防控。

1材料與方法

1.1試驗材料

苦瓜枯萎病原菌強致病菌株FJAT-3018屬于尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.Momodicae），由本研究室保存;供試苦瓜感病品種（新翠）植株購自廈門如意種苗高科技股份有限公司;農(nóng)桿菌AGL-1菌株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈，載體pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供;潮霉素B、卡那霉素、特美汀等抗生素均購白美國Sigma公司;PDB培養(yǎng)基（200g馬鈴薯，15g葡萄糖，加水定容至1000 mL）;PDA固體培養(yǎng)基（200g馬鈴薯，15g葡萄糖，15g瓊脂粉，加水定容至1000mL），篩選培養(yǎng)基（含終濃度為100μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA固體培養(yǎng)基）;農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化所需的試劑及3種培養(yǎng)基配方（基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基）參考文獻[15]，具體配方見表1?；旌侠w維微孔濾膜（購白上海生工）.0.22μm微孔過濾器（Millipore）。

1.2苦瓜枯萎病菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行苦瓜枯萎病菌的gfp基因轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照文獻[15]，略做改動。具體步驟如下：（1）苦瓜枯萎病原菌菌株FJAT-3018于含200μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)7d，在培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，用無菌涂布棒刮洗菌落表面洗出分生孢子，孢子懸浮液用雙層無菌擦鏡紙過濾，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)基調(diào)整分生孢子濃度為1×106個·mL-1備用。（2）將已轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp載體的農(nóng)桿菌AGL-1用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM培養(yǎng)基）于28℃、250r·min-1搖床培養(yǎng)48h，后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM培養(yǎng)基）調(diào)整菌液濃度為OD600=0.15，繼續(xù)搖床培養(yǎng)約6h至菌液OD600約為0.60。（3）將滅菌的混合纖維微孔濾膜放置在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（CM培養(yǎng)基）上，并取已制備好的FJAT-3018孢子懸浮液和農(nóng)桿菌液各100μL混勻后于混合纖維微孔濾膜上均勻涂布，10個重復(fù)，并于25℃暗培養(yǎng)48h。（4）共培養(yǎng)48h后，將混合纖維微孔濾膜用無菌刀片劃成小塊分散擺放到篩選培養(yǎng)基（含終濃度為150μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA培養(yǎng)基）上，于28℃暗培養(yǎng)72h。（5）篩選培養(yǎng)基平板放置在BD-BGC1藍光切膠儀中，挑取發(fā)出明亮綠色熒光菌落邊緣的菌絲體于篩選培養(yǎng)基上復(fù)篩，繼續(xù)用藍光切膠儀挑選出發(fā)出明亮綠色熒光的平板，并通過單孢分離法獲得相對應(yīng)轉(zhuǎn)化子。

1.3轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測

單孢分離純化獲得的強綠色熒光表達的不同轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6d后，選取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)以上方法連續(xù)培養(yǎng)10代，觀察各轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)變化，測量菌落生長速度，以野生型菌株FJAT-3018為對照。挑取熒光強且遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子于-80℃甘油冷凍保存，同時挑取代表性轉(zhuǎn)化子的菌絲體制成玻片，置于熒光顯微鏡下觀察菌絲和孢子的熒光強度。

1.4轉(zhuǎn)化子對苦瓜植株的致病性測定

選取2株代表性轉(zhuǎn)化子和野生型菌株FJAT-3018分別于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，雙層紗布過濾后分別調(diào)整孢子懸浮液濃度為106個·mL-1備用。取株高為10～15cm的苦瓜實生苗用栽培基質(zhì)種植于盆缽中，7d后用轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液傷根澆灌接種，每株澆灌50mL，以野生型菌株FJAT-3018和清水處理為對照，每處理組分別接種30株苦瓜苗，于（28±2）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逐日觀察苦瓜苗的發(fā)病情況，通過發(fā)病速度和發(fā)病率比較轉(zhuǎn)化子與野生型菌株的致病力差異?？喙厦?片及以上葉片表現(xiàn)萎蔫癥狀即計為發(fā)病株，發(fā)病率=（各處理組發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%。同時，在接種后7d和14d拔取發(fā)病植株分段切片檢測，植株從盆缽中拔出后用流水將根及莖部表皮雜質(zhì)沖洗干凈，采用徒手切片法，切取根部及莖部組織薄片，放置于載玻片上，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）于波長500～525nm下觀察病原菌在植株根部與莖部的侵染情況。

2結(jié)果與分析

2.1苦瓜枯萎病菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行菌株FJAT-3018的gfp基因轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，共培養(yǎng)后的10張混合纖維微孔濾膜在篩選培養(yǎng)基上共長出145個發(fā)綠色熒光的菌落，遺傳轉(zhuǎn)化效率約為14.5個轉(zhuǎn)化子/106個孢子。發(fā)光菌落復(fù)篩后，經(jīng)單孢分離和熒光強度檢測挑取15個綠色熒光基因強表達的轉(zhuǎn)化子（編號為FJAT-31284～FJAT-31298）進行保存。

2.2轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測

15個轉(zhuǎn)化子在無潮霉素選擇壓力的PDA培養(yǎng)基上分別繼代培養(yǎng)10次后，菌落形態(tài)、色澤與野生型較一致（圖1-A、B）。各轉(zhuǎn)化子在藍光切膠儀中菌落呈現(xiàn)明亮的綠色（圖1-C）。轉(zhuǎn)化子的菌絲、產(chǎn)孢器和分生孢子在顯微鏡下與野生型菌株一致，且在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光（圖1-D～F）。培養(yǎng)7d時的平均生長速率為（6.6±0.6）cm，與野生型菌株FJAT-3018的生長速率（6.5±0.5）cm差異不顯著。通過菌落形態(tài)、生長速率和綠色熒光檢測，說明gfp基因已成功轉(zhuǎn)入到菌株FJAT-3018中，且各轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3轉(zhuǎn)化子對苦瓜植株的致病性測定

接種野生菌株FJAT-3018和轉(zhuǎn)化子FJAT-31284、FJAT-31290的苦瓜植株，在接種約7d時，不同處理的植株葉片均開始出現(xiàn)輕微萎蔫癥狀;接種10d左右，植株大部分葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀;接種14d后，植株完全萎蔫死亡;但清水處理的植株無萎蔫癥狀，正常生長（圖2）。發(fā)病率統(tǒng)計結(jié)果表明，接種野生菌株FJAT-3018和轉(zhuǎn)化子FJAT-31284、FJAT-31290的植株發(fā)病率均為100%，清水對照發(fā)病率為0。重新分離接種病原菌FJAT-3018和轉(zhuǎn)化子FJAT-31284、FJAT-31290的回接發(fā)病植株，均獲得與接種時相同的病原物;清水對照未分離到培養(yǎng)物。進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子FJAT-31284和FJAT-31290在苦瓜植株體內(nèi)的侵染情況，結(jié)果表明，接種兩個轉(zhuǎn)化子7d時，植株的少許根部出現(xiàn)褐變，此時均可觀察到呈現(xiàn)綠色熒光的菌絲體在根部組織細胞間隙侵染蔓延，但在莖部組織尚未檢測到綠色熒光的菌絲體（圖3-A、B）;接種轉(zhuǎn)化子14d時，大部分根部組織褐變，距離莖基部1-2cm處的莖組織切片后，均可觀察到大量呈現(xiàn)綠色熒光的菌絲體在莖部組織細胞間隙侵染蔓延（圖3-C、D）。通過致病力測定和侵染觀察，說明供試的2個轉(zhuǎn)化子對苦瓜植株的致病力與野生型菌株較一致，且兩個轉(zhuǎn)化子均能在植株體內(nèi)侵染蔓延并呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。

3討論與結(jié)論

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化已在淡紫擬青霉Paecilomvces lilacinus、小麥赤霉菌F.graminearum和稻瘟病菌Magnaporthe grisea等多種作物真菌上應(yīng)用[14，16-17]。但農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效率會受到多種因素的影響，如農(nóng)桿菌菌株類型、轉(zhuǎn)化受體菌株類型、乙酰丁香酮濃度等因素[18]。任俊杰等[19]轉(zhuǎn)化西瓜枯萎病菌的效率為1177個轉(zhuǎn)化子/106個孢子;劉朋娟等[20]轉(zhuǎn)化稻瘟病菌的效率為約300個轉(zhuǎn)化子/106個孢子;本研究轉(zhuǎn)化苦瓜枯萎病菌的效率約為14.5個轉(zhuǎn)化子/106個孢子。雖然本研究的轉(zhuǎn)化效率略低，但是所獲得轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)、生長速率和致病力等方面與野生型菌株FJAT-3018相比無明顯差異，且均能穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白基因，該結(jié)果與姚錦愛等[17]、任俊杰等[19]和郭強等[21]的研究結(jié)果一致。綠色熒光蛋白基因標記是研究病原菌與寄主植物互作的良好可視化工具[3]。Zvirin等[22]和李春強等[23]分別利用gfp基因標記的甜瓜尖孢鐮刀菌和西瓜尖孢鐮刀菌菌株，研究了病原菌在寄主植株的侵染定殖，結(jié)果表明在激光共聚焦顯微鏡下，能清晰地觀察到發(fā)熒光的病原菌菌絲體在植株體內(nèi)侵染蔓延。本研究也利用激光共聚焦顯微鏡觀察了2個轉(zhuǎn)化子FJAT-31284和FJAT-31290在苦瓜植株體內(nèi)的侵染定殖，也表明轉(zhuǎn)化后的菌株均能在植株體內(nèi)侵染蔓延且穩(wěn)定表達。綠色熒光蛋白基因已成功轉(zhuǎn)入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性且致病力不受影響。后續(xù)將利用成功標記gfp基因且遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子進行示蹤觀察，為研究病原菌在苦瓜植株體內(nèi)的侵染特性提供可視化跟蹤檢測手段。

參考文獻：

[1]SUN S K，HUANG J w A new Fusarium wilt of bitter gourd inTaiwan[J].Plant Disease，1983，67（2）：226-227.

[2]關(guān)峰，萬新建，張景云，等.苦瓜枯萎病研究進展[J].中國瓜菜，2018. 31（5）：1-4.

GUAN F，WAN X J，ZHANG J Y，et al.Research progress onFusarium wilt of bitter gourd[J].China Cucurbits and Vegetables，2018，31（5）：1-4.（in Chinese）

[3]SARROCCO S， FALASCHI N， VERGARA M，et al. Use of Fusariumoxysporum f. sp dianthii transformed with marker geneS tO follOwcolonization of camation roots[J]. Journal of Plant Pathology，2007，89（1）：47-54.

[4]黃亞麗，潘瑋.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展[J].生物技術(shù)通報，2007（3）：111-114.

HUANG Y L，PAN W. TranSfomatiOn in Filamentous fungi mediatedby Agrobacterium tumefaciens[J].Biotechnology，2007（3）：111-114.（inChinese）

[5]徐進，莫明和，張克勤.綠色熒光蛋白（GFP）在真菌研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)，2004，14（6）：74-77.

XU J，MO M H，ZHANG K Q.The application of gene fluorescentprotein（GFP）in Fungi[J].Biotechnology，2004，14（6）：74-77.（in Chinese）

[6]肖榮鳳，朱育菁，李燕丹，等.西瓜尖孢鐮刀菌FOV-135的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，24（6）：521-524.

XIAO R F，ZHU Y J，LI Y D，et al.Green fluoresCent protein genetranSfomatiOn On Fusarium oxysporum f.sp.niveum straiin，F(xiàn)OV-135[J]. Fujian Journal of Agricultural Science，2009，24（6）：521-524.（in Chinese）

[7]張鴻，林志堅，林趙淼，等.T-DNA隨機插入法獲得甘薯蔓割病菌非致病生防菌株[J].中國生物防治學(xué)報，2016，32（5）：610-618.

ZHANG H， LIN Z J，LIN Z M. et al.Obtaining nonpathogenicbiological control strains against sweetpotato Fusarium wilt byAgrobacterium-mediated transformation [J]. Chinese Journal ofBiological Control，2016，32（5）：610-618.（in Chinese）

[8]孫科.基因槍法介導(dǎo)的抗赤霉病防衛(wèi)基因轉(zhuǎn)化小麥的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

SUN K. Studies on the transformation of wheat with defense genesresistant to FHB by microprojectile bombardment[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University，2013.（in Chinese）

[9]張俊華，劉燁，韓雨桐，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌綠色熒光蛋白（GFP）遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，45（11）：1-7.

ZHANG J H， LIU Y， HAN Y T，et al.GFP genetic transformation ofMagnaporthe grisea mediated by Agrobacterium tumefaciens [J].Journal of Northeast Agricultural University，2014，45（11）：1-7.（in Chinese）

[10]NAHALKOVA J， FATEHI J. Red fluorescent protein （DsRed2） as anovel reporter in Fusarium oxysporumf. sp. lycopersici [J]. FEMSMicrobiology Letters，2003，225（2）：305-309.

[11]VISSER M.，GORDON T R. WINGFIELD B D. et al. Transformationof Fusarium oxysporum f. sp. cubense causal agent of Fuasrium wiltof banana，with the green fluorescent protein （GFP） gene [J].Australasian Plant Pathology， 2004，33（1）：69-75.

[12]張欣.香蕉枯萎病菌遺傳多態(tài)性及綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化的研究[D].儋州：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]NONOMURA T， TAJIMA H. KITAGAWA Y. et al.Distinguishablestaining with neutral red for GFP-marked and GFP-nonmarkedFusarium oxysporum strains simultaneously colonizing rootsurfaces [J]. Journal of General Plant Pathology，2003，69（1）：45-48.

[14]WU L，CONNER R L，WANG X M， et al. Variation in growth，colonization of maize， and metabolic parameters of GFP-and DsRed-Labeled Fusarium verticillioides strains [J]. Phytopathology， 2016，106（8）：890-899.

[15]KHANG C H，PARK S Y. RHO H S，et al.Filamentous fungi（Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum）[M]//AgrobacteriumProtocols Volume 2. Totowa. NJ：Humana Press， 2006：403-420.

[16]張旭，Theo van de Lee，陸維忠，等.小麥赤霉菌綠色熒光蛋白標記突變體的侵染研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（10）：3077-3082.

ZHANG X，THEO V D L，LU W Z，et al.Infection of Fusariumgraminearum on wheat spikes with green fluorescence protein-taggedrevertants [J]. Scientia Agricultura Sinica，2008，41（10）：3077-3082.（in Chinese）

[17]姚錦愛，張鴻，黃鵬，等.建蘭莖腐病原菌尖孢鐮刀菌F-02的綠色熒光蛋白基因標記[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，34（1）：70-75.

YAO J A，ZHANG H，HUANG P，et al. Green fluorescent proteingenetic marker of Fusarium oxysporum F-02 of stem rot disease onCymbidium ensifolium [J].Fujian Journal of Agricultural Sciences，2019，34（1）：70-75.（in Chinese）

[18]張俊華，牟明，常浩，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)gfp基因轉(zhuǎn)化水稻紋枯病菌及其對病原菌穩(wěn)定性和致病力的影響[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，41（6）：67-74.

ZHANG J H，MU M，CHANG H，et a1.Agrobacterium Tumefaciens-mediated transformation of gfp gene and its effects on stability andpathogenicity for Rhizoctonia solani[J]. Journal of NortheastAgricultural Aciences，2016，41（6）：67-74.（in Chinese）

[19]任俊杰，王麗霞，高洪波，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜枯萎病菌遺傳轉(zhuǎn)化[J].植物保護，2015，41（1）：93-97.

REN J J，WANG L X，GAO H B，et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusarium oxysporum f.sp niveum[J].Plant Protection，41（1）：93-97.（in Chinese）

[20]劉朋娟，王政逸，王秋華，等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化及致病缺陷突變體篩選[J].中國水稻科學(xué)，2006，20（3）：231-237.

LIU P J，WANG Z Y，WANG Q H，et a1.Agrobacterium tume faciens-mediated transformation of Magnaporthe

andidentification of pathogenicity defective mutant[J].Chinese Journalof RICE sCIENCE，2006，20（3）：231-237.（in Chinese）

[21]郭強，王鑫，徐世強，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌YN41的遺傳轉(zhuǎn)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016， 35（5）：1189-1194.

GUO Q，WANG X，XU S Q，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of sugarcane pokkah boeng pathogenYN41[J]. Genomics and Applied Biology， 2016，35（5）：1189-1194. （in Chinese）

[22]ZVIRIN T，HERMAN R，BROTMAN Y，et al. Differentialcolonization and defence responses of resistant and susceptible melonlines infected by Fusarium oxysporum race 1-2[J]. Plant pathology，2010（59）：576-585.

[23]李春強，梁慧施，夏亦薺，等.GFP標記的尖孢鐮刀菌西瓜?；颓秩疚鞴线^程觀察[J].熱帶作物學(xué)報，2011，32（10）：1935-1939.

LI C Q，LIANG H S H，XIAY J， et al.Observation of the infectionprocess of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum using theGFP marker [J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2011，32（10）：1935-1939.（in Chinese）

（責(zé)任編輯：林海清）

陳燕萍，劉欣，肖榮鳳，等.苦瓜枯萎病原菌的綠色熒光蛋白基因標記[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，35（11）：1228-1233.

CHEN Y P，LIU X. XIAO R F，et al. Transformation of Green Fluorescent Protein of Fusarium oxysporum Isolated from Diseased Bitter Gourd [J].Fujian Journal ofAgricultural Sciences，2020，35（11）：1228-1233

收稿日期：2020-09-14初稿：2020-10-14修改稿

作者簡介：陳燕萍（1985-），女，碩士，助理研究員，主要從事生物技術(shù)及生物防治（E-mail：chenyanping071@sina.com）

*通信作者：劉波（1957-），男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物研究（E-mail：fzliubo@163.com）

基金項目：福建省科技計劃公益類專項（2018Rl017-9）：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（STIT2017-2-8）