王艷艷 劉長河 葛文靜 李華妮

摘 要 目的：比較感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物的3種不同制備方法，篩選最佳的制備工藝。 方法：以揮發(fā)油包合率、包合物收得率綜合評分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法對飽和溶液法、研磨法和超聲法包合揮發(fā)油的工藝進(jìn)行比較。 結(jié)果：飽和溶液法包合率和收得率分別為90.0%和78.8%；研磨法包合率和收得率分別為91.1%和73.3%；超聲法包合率和收得率分別為74.3%和72.9%。 結(jié)論：研磨法制備揮發(fā)油包合物具有時間短、包合率和收得率較高的特點(diǎn)，優(yōu)于飽和溶液法和超聲法，并且包合物具有一定的抗光照性、熱及濕穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞 感冒清熱顆粒 揮發(fā)油 β-環(huán)糊精 包合工藝

中圖分類號：R283 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）17-0065-06

*基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2017zyo6o9）

Comparative study on the process of including volatile oil from Ganmaoqingre granules with β-cyclodextrin and its stability*

WANG Yanyan**， LIU Changhe***， GE Wenjing， LI Huani

（Henan Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy， Zhengzhou 450004， China）

ABSTRACT Objective： Three different methods for the preparation of volatile oil inclusion compound of Ganmaoqingre granules were compared and the best one was screened out. Methods： The processes for the volatile oil inclusion prepared by saturated solution method， grinding and ultrasonic methods were compared based on the comprehensive score of the rate of volatile oil inclusion and the yield of inclusion compound as indicators by orthogonal test method. Results： The inclusion rate and the yield were 90.0% and 78.8% for saturated solution method， 91.1% and 73.3% for grinding method and 74.3% and 72.9% for ultrasonic method， respectively. Conclusion： The grinding method for the preparation of volatile oil inclusion compound has the characteristics of short time， high inclusion rate and high yield and is superior to other ones and the prepared inclusion compound has higher capability of light- and heat- resistance and humidity stability.

KEy WORDS Ganmaoqingre granules； volatile oil； β-cyclodextrin； process

感冒清熱顆粒由陳皮、桂枝、甘草等組成，具有清熱化痰、止咳平喘等功效，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。陳皮、桂枝含揮發(fā)性成分，并與功能主治相關(guān)。陳皮來源于蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮。陳皮揮發(fā)油具有抑制平滑肌運(yùn)動功能[1]；桂枝為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥嫩枝。桂枝揮發(fā)油具有抗菌、抗流感病毒作用[2]。為了避免從多味藥材中提取的揮發(fā)油在制劑制備和貯運(yùn)過程中揮散損失，降低藥效，采用b-環(huán)糊精將揮發(fā)油包結(jié)起來，制成包合物加入制劑中。單味陳皮、單味桂枝及含單味陳皮、單味桂枝復(fù)方揮發(fā)油的包合多采用飽和溶液法[3-7]，也有研磨法[8-9]、超聲法[10-12]的報(bào)道。未見陳皮、桂枝混合揮發(fā)油包合研究報(bào)道。本研究采用水飽和法、研磨法、超聲法制備包合物，并比較三種方法的優(yōu)劣。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯）；揮發(fā)油測定器（鄭州玻璃儀器廠）；LRH-250-Y培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）。

感冒清熱顆粒揮發(fā)油（批號20140401）由我院制劑室提供，主要含有芳香族化合物和萜類化合物，如桂皮醛，檸檬烯等，該類化合物具有揮發(fā)性，對空氣、光、熱比較敏感，難溶于水，能完全溶解于無水乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油中；β-環(huán)糊精（批號20140906，廣東郁南糊精有限公司）；硅膠G薄層板（批號20130702，青島海洋化工有限公司）；自制蒸餾水；其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

按處方比例稱取陳皮、桂枝，加水10倍量，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油4 h，收集揮發(fā)油。結(jié)果藥材含揮發(fā)油0.7%。加大藥材量提取揮發(fā)油，備用。

1.2.2 揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備

1）飽和溶液法 按正交表精密稱取β-環(huán)糊精，置具塞三角瓶中，加入蒸餾水100 ml，加熱至溶解，降至正交表需要溫度，恒溫?cái)嚢?；按正交試?yàn)表各因素水平實(shí)驗(yàn)，吸取揮發(fā)油溶液3 ml，加等量無水乙醇稀釋至6 ml，然后緩緩滴加入β-環(huán)糊精溶液中，分別攪拌30、60、90 min。

2）研磨法 按正交表精密稱取β-環(huán)糊精，置燒杯中，按正交試驗(yàn)表需要量加入蒸餾水，加入β-環(huán)糊精，混勻，置膠體磨開始研磨，按正交試驗(yàn)表吸取揮發(fā)油溶液3 ml，加等量無水乙醇稀釋至6 ml，研磨時緩緩滴加入β-環(huán)糊精溶液中，分別研磨10、20、30 min，用適量水沖洗膠體磨，沖洗液加入研磨液中；

3）超聲法 按正交表精密稱取β-環(huán)糊精，置具塞三角瓶中，按正交試驗(yàn)表需要量加入蒸餾水，混勻，吸取揮發(fā)油溶液3 ml，加等量無水乙醇稀釋至6 ml，加入β-環(huán)糊精溶液中，分別超聲（350 W、50 kHz）30、45、60 min。

上述各個正交試驗(yàn)樣品置冰箱中（10 ℃以下）放置 72 h，過濾，用乙醚適量洗去包合物表面黏附的揮發(fā)油，60 ℃干燥12 h，得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，稱重，計(jì)算收得率。

1.2.3 揮發(fā)油密度的測定

揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥（用裝有無水硫酸鈉的小柱濾過，除去水分）。精密吸取2 ml，測定重量，求得揮發(fā)油密度。揮發(fā)油密度=（油和容器重量-容器重量）÷2.0×100%=950.2 mg/ml，RSD為0.36%。

1.2.4 揮發(fā)油包合率收得率的測定

取干燥的揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，加蒸餾水200 ml，照《中國藥典》2015年版[13]測定包合物中油的含量，計(jì)算揮發(fā)油包合率（%）和收得率（%）。

揮發(fā)油包合率（%）=包合物中揮發(fā)油的含量/揮發(fā)油加入量×空白回收率×100%

收得率（%）=包合物量（g）/（環(huán)糊精量+揮發(fā)油加入量×揮發(fā)油密度）×100%

1.2.5 綜合評分

揮發(fā)油包合率是評判包合效果的主要指標(biāo)，包合率越高，包合效果越好，因而作為揮發(fā)油包合工藝篩選的重要指標(biāo)，根據(jù)實(shí)際情況，包合率權(quán)重系數(shù)定為0.8[14]；同時收得率在大生產(chǎn)中對于節(jié)省原材料成本具有重要意義，在b-環(huán)糊精和揮發(fā)油投入量一定的情況下，收得率高，說明包合效果好，故揮發(fā)油包合物收得率作為次要篩選指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.2。

綜合評分=包合率×80%+收得率×20%

1.2.6 空白回收率試驗(yàn)

空白回收率（%）的測定：精密吸取揮發(fā)油1.0 ml，共3份，分別置于燒瓶中，加水200 ml，照《中國藥典》2015年版測定揮發(fā)油的提出量（ml），計(jì)算空白回收率（%），本研究測得的空白回收率平均值為95%。

1.2.7 揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的鑒別

1）顯微成像法 取飽和溶液法、研磨法、超聲法制備的揮發(fā)油包合物、空白包合物（按包合工藝制備），置于顯微鏡下觀察。

2）薄層色譜法 取上述按照不同工藝制備的揮發(fā)油b-環(huán)糊精包合物各0.5 g，加無水乙醇10 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液作為供試品溶液；同法制備空白包合物供試品溶液；另取揮發(fā)油各0.1 ml，加無水乙醇10 ml使溶解，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各5 ml，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-醋酸乙酯（10∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[15-16]。

3）紫外分光光度法 取上述按照不同工藝制備的包合物及空白β-環(huán)糊精各1 g，加無水乙醇10 ml，振搖后靜置1 h，過濾，取濾液作為供試品溶液，取2.4.2項(xiàng)下的對照品溶液，作為對照品溶液。將上述溶液分別置紫外可見分光光度計(jì)上于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描[17-18]。

2 結(jié)果

2.1 影響因素

飽和溶液法影響包合結(jié)果的主要因素為β-環(huán)糊精的用量和揮發(fā)油的比例、包結(jié)溫度和包結(jié)時間；研磨法的主要影響因素有β-環(huán)糊精的用量和揮發(fā)油的比例、加水量（為揮發(fā)油的倍數(shù)）和研磨時間；超聲法影響包結(jié)效果的主要因素為β-環(huán)糊精的用量和揮發(fā)油的比例、加水量（為揮發(fā)油的倍數(shù)）和超聲時間。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響揮發(fā)油包結(jié)的因素見表1。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)表的各因素、水平值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飽和溶液法、研磨法和超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%和74.3%；收得率分別為78.8%、73.3%和72.9%。飽和溶液法和研磨法的包合作用較好（表2和表3）；方差分析結(jié)果見表4。

2.2.1 飽和溶液法結(jié)果分析

1）直觀分析 根據(jù)極差大小，以包結(jié)率、收得率綜合評分為考察指標(biāo)，選擇A3B2C3（表3）。

2）方差分析 由直觀分析可知，影響揮發(fā)油包合效果的因素為包結(jié)溫度>b-環(huán)糊精和油的比例>包結(jié)時間。經(jīng)方差分析，b-環(huán)糊精和油的比例、包結(jié)溫度和包結(jié)時間均無顯著性影響。但b-環(huán)糊精和油的比例對包結(jié)率具有一定的影響，即：包結(jié)率隨著b-環(huán)糊精的量的增加而增大。因此選擇A3B3C3，即：環(huán)糊精與油的比例為9∶1，50 ℃，攪拌包結(jié)1.5 h。

2.2.2 研磨法結(jié)果分析

1）直觀分析 根據(jù)極差大小，選擇A3B3C1。

2）方差分析 由直觀分析可知，影響揮發(fā)油包結(jié)效果的因素為b-環(huán)糊精和油的比例>加水量>包結(jié)時間。經(jīng)方差分析，b-環(huán)糊精和油的比例具極顯著影響；加水量和包結(jié)時間均無顯著性影響。但加水量具有一定的趨勢。因此選擇A3B3C1，即：環(huán)糊精與油的比例為9∶1，加水100倍（揮發(fā)油量），研磨包結(jié)10 min。

2.2.3 超聲法結(jié)果分析

1）直觀分析 根據(jù)極差大小，選擇A3B2C1。

2）方差分析 經(jīng)方差分析，超聲法包結(jié)揮發(fā)油，影響揮發(fā)油包結(jié)效果的因素為b-環(huán)糊精和油的比例對包合效果有顯著性影響，加水量和包結(jié)時間均無顯著性影響。因此選擇A3B2C3，即：環(huán)糊精與油的比例為9∶1，加水200倍（揮發(fā)油量），超聲包結(jié)45 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述正交試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行揮發(fā)油包合的驗(yàn)證試驗(yàn)，取三次實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果飽和溶液法、研磨法、超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%、74.3%；收得率分別為78.8%、73.3%、72.9%。飽和溶液法、研磨法、超聲法的綜合評分結(jié)果分別為87.76（RSD=0.75）、87.54（RSD=1.05）、74.02（RSD=1.22），與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，表明上述揮發(fā)油包合工藝穩(wěn)定、可行，可以作為感冒清熱顆粒中揮發(fā)油包合的參考。

2.4 揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的鑒別

2.4.1 顯微成像法

取飽和溶液法、研磨法、超聲法制備的揮發(fā)油包合物、空白包合物（按包合工藝制備），置于顯微鏡下觀察，不同工藝的包合物為不透明塊狀，空白包合物呈規(guī)則的半透明狀。結(jié)果表明揮發(fā)油與β-環(huán)糊精確已形成了包合物（圖1）。

2.4.2 薄層色譜法

樣品溶液1、2、3和對照品溶液4在相應(yīng)的位置出現(xiàn)了黃色斑點(diǎn)，且Rf值基本一致，表明揮發(fā)油包合前后化學(xué)性質(zhì)沒有發(fā)生變化（圖2）。

2.4.3 紫外分光光度法

將供試品溶液和對照品溶液分別置紫外可見分光光度計(jì)上于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果揮發(fā)油在290 nm有最大吸收。而上述揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物及空白β-環(huán)糊精在此處無吸收峰。表明揮發(fā)油全部與β-環(huán)糊精形成了包合物（圖3）。

2.5 三種方法包合揮發(fā)油的工藝比較

飽和溶液法、研磨法、超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%、74.3%，收得率分別為78.8%、73.3%、72.9%。飽和溶液法和研磨法的包合率和收得率均大于超聲法，所以兩種方法均適合于揮發(fā)油包合物的制備，但研磨法的制備時間較短，因此研磨法優(yōu)于飽和溶液法。

2.6 揮發(fā)油包合物的穩(wěn)定性研究

2.6.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于4 500 lx光照下照射10 d，分別于第0、5和10 天取樣測定，結(jié)果表明，物理混合物在第5天和第10天的揮發(fā)油相對含量下降明顯，包合物的揮發(fā)油相對含量下降較少，后者具有較好的光穩(wěn)定性，在強(qiáng)光照射下不易分解。

2.6.2 高溫試驗(yàn)

分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于60 ℃高溫下放置10 d，分別于第0、5和10天取樣測定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，包合物的揮發(fā)油相對含量呈下降的趨勢，但與物理混合物相比，后者的揮發(fā)油相對含量下降更為明顯，可見，揮發(fā)油包合物的熱穩(wěn)定性優(yōu)于物理混合物，在高溫條件下分解較緩慢。

2.6.3 高濕試驗(yàn)

分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于75%高濕條件下放置10 d，分別于第0、5和10天取樣測定，結(jié)果表明，包合物受高濕條件的影響比較小，表現(xiàn)為揮發(fā)油的相對含量下降少，而物理混合物的揮發(fā)油相對含量明顯下降，說明了包合物在高濕條件下的穩(wěn)定性高于混合物（表5）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的飽和溶液方法，首先在一定的溫度情況下環(huán)糊精形成飽和溶液后冷卻至50 ℃再滴入揮發(fā)油的乙醇溶液，使環(huán)糊精分子的中空結(jié)構(gòu)與揮發(fā)油充分接觸，因此包合時間短，所選擇的溫度較低也能減少揮發(fā)油的損失，包合率和收得率高于文獻(xiàn)報(bào)道[3，5，10]。

對于研磨法制備包合揮發(fā)油，由于研磨過程中產(chǎn)生熱量容易使包合體溫度升高，從而加大揮發(fā)油易逸失的速度，因此利用膠體磨研磨包合時，利用水冷卻膠體磨，使包合體的溫度保持在較低水平，與文獻(xiàn)比較研磨時間較短并且具有較高的包合率[6，11]。

超聲法包合實(shí)驗(yàn)時，若用飽和溶液超聲，待冷卻后容易形成環(huán)糊精結(jié)晶析出，同時溶液表面有明顯的油滴，說明沒有包結(jié)完全，因此選用常溫包結(jié)。超聲包合時間與超聲儀的功率有關(guān)，功率越大，揮發(fā)油吸收能量分散成小微粒的時間越短。超聲法包合揮發(fā)油可能是環(huán)糊精分子分散與揮發(fā)油分子之間的動態(tài)平衡過程，在這個過程中，有一部分的揮發(fā)油分子處于游離狀態(tài)，因此超聲法的包合率低于飽和溶液和研磨法。飽和溶液法和研磨法均可以用于包結(jié)本品的揮發(fā)油，可根據(jù)企業(yè)設(shè)備情況選定包結(jié)方法。超聲法的包結(jié)率較低，因此不選用。

研磨法制備揮發(fā)油包合物具有時間短、包合率和收得率較高的特點(diǎn)，優(yōu)于飽和溶液法和超聲法。與物理混合物相比，揮發(fā)油包合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)證實(shí)了其在強(qiáng)光、高溫、高濕條件下的穩(wěn)定性均有一定程度的提高，達(dá)到了減少揮發(fā)油揮散的目的。

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