廖栩崢，陳金榮，秦海鵬，王博，胡世康，孫成波

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

我國已成為世界上對蝦養(yǎng)殖面積最大和產量最高的國家。自2001年以來，我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖面積和產量逐年增加，現已成為水產養(yǎng)殖業(yè)中重要的支柱性產業(yè)[1]。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）擁有生長速度快，對環(huán)境的適應性強等優(yōu)點[2]。在20世紀80年代末，我國將其引入，并在人工育苗方面獲得成功[3]。近年來，隨著養(yǎng)殖的規(guī)模擴大和集約化程度的提高，養(yǎng)殖對環(huán)境的污染、養(yǎng)殖生物疾病的暴發(fā)和化學藥物的殘留等問題日益突出，對凡納濱對蝦的養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展帶來了嚴重影響。目前對蝦養(yǎng)殖業(yè)的所需做的任務之一應為進一步提高高位池養(yǎng)殖技術，生物絮團技術可作為一種新的思路。當今對蝦高位池養(yǎng)殖的硬件設施以及管理操作等應用為發(fā)展生物絮團技術提供了必要條件[4]。生物絮團技術（Biofloc Technology）的研究和發(fā)展為對蝦養(yǎng)殖提供了有效的技術支撐和解決方法[5]。基于生物絮團技術的養(yǎng)殖模式符合當代養(yǎng)殖發(fā)展的要求，是我國對蝦養(yǎng)殖的發(fā)展方向。

以色列學者Avnimelech在1999年系統(tǒng)地提出了關于在養(yǎng)殖系統(tǒng)中投入的C/N比對養(yǎng)殖系統(tǒng)水質調控的生物絮團反應機制理論[6]，通過將生物絮團技術投入到現實的生產，此舉對養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸氮水平有著顯著的降低作用[7]。生物絮團是以異養(yǎng)菌為主的菌膠團，經生物絮凝作用結合水體中有機質、原生動物、藻類、絲狀菌等形成的絮狀物[8]。目前我國的傳統(tǒng)水產養(yǎng)殖的生產中，由于殘餌和養(yǎng)殖動物排泄物得不到及時分解，水體中的氮經常會處于高水平，這時候通過添加碳源，異養(yǎng)微生物就開始同化水體無機氮從而轉化為自身蛋白，并且生物絮團含有可被對蝦攝食的營養(yǎng)物質，提高飼料的利用率，減少投餌量，此外生物絮團含有大量活性物質可以提高對蝦的非特異性免疫力[9]。生物絮團技術目前還很不成熟，生產上生物絮團的形成容易受到許多因素的影響，例如溫度、鹽度和pH值等。國外已有報道相似，國內生物絮凝培養(yǎng)取得了理想效果，顯著提高了生長率，增加了誘餌系數，明顯著抑制了弧菌的產生，穩(wěn)定了水質，使得對蝦的硝化沒活力和免疫酶活力得到提高[10]。

由于很多機理沒研究透徹導致室外不可控因素較多,現在大部分生物絮團的形成是在室內養(yǎng)殖池塘，該試驗在室外養(yǎng)殖池塘培養(yǎng)生物絮團，以期為對蝦生物絮團養(yǎng)殖奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點在廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地進行，試驗時間為123 d。試驗挑選體長為（2.35±0.40）cm，體質量為（0.16±0.07）g體質健壯的凡納濱對蝦作為試驗用蝦，池塘面積為800 m2，池塘中放入130 000尾對蝦。試驗通過接種生物絮團，添加氮源和碳源，維持水體C/N為15∶1，構建室外生物絮團池，試驗過程中適量補充碳源。投喂時間為 07：00、11：00、18：00、23：00，每天觀察對蝦的攝食情況和生長情況。

1.2 方法

1.2.1 測定指標

試驗期間每日08：00點進行水體理化因子的測定。pH值、溫度、鹽度檢測方法使用電子儀器檢測；氨氮（TAN）采用靛酚藍法，亞硝酸鹽（Nitrite）采用重氮-偶氮法，硝酸鹽（Nitrate）采用鋅-鎘還原法，弧菌菌落數、總菌菌落數使用稀釋涂步平板計數法。

1.2.2 主要試劑與器具

磺胺（10 g/L），鹽酸納乙二胺溶液（1 g/L），氯化鎘溶液（20%），鋅卷（AR）（5 cm×6 cm），檸檬酸鈉（480 g/L），苯酚溶液，次氯酸鈉溶液（1.50 mg/mL有效氯），鹽酸（0.018 mol/L），酚酞指示劑，甲基紅-次甲基藍混合指示劑，營養(yǎng)瓊脂，TCBS培養(yǎng)基。筆式酸度計pH-220（杭州齊威儀器有限公司）。

1.2.3 樣品的采集和DNA的提取

將采集的水樣用0.22 μm濾膜對室外生物絮團水進行真空抽濾，每張濾膜過濾150 mL的養(yǎng)殖海水，將濾膜置于50 mL的離心管中，放入-80℃冰箱中保存。DNA提取根據DNA Isolation Kit（美國Hipurte Power SoilR）說明書進行。

1.2.4 PCR擴增

引物設計：341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’；806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。反應體系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus）10 μl，dNTP混合物（2.5 mM each）4 μL，上下游引物（5 μM）各 1 μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，DNA模板10 ng，補充超純水至20μl。PCR反應參數：預變性：1×（1min，98°C）；循環(huán)：27×（30 s，98 °C；30 s，55 °C；30 s，72 °C）；后延伸：5 min，72 °C。

1.2.5 數據統(tǒng)計與分析

使用EXCEL軟件列出各個指標變化值并且處理試驗組與對照組不同數據間的變化趨勢圖。試驗數據運用平均值+標準差表示，采用SPSS17.0軟件對數據進行單因素方差分析，結合Duncan’s法進行多重比較，P<0.05時處理組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物絮團對氨氮的影響

氨氮的最高濃度在第28天，濃度為（8.53±0.60）mg/L，之后開始下降，第30 天達到最低值（1.70±0.15）mg/L。在80 d之后的試驗養(yǎng)殖周期氨氮較為平穩(wěn)，大部分在1 mg/L以下，最低值在第88天和第108天，濃度為（0.24±0.05）mg/L。

2.2 生物絮團對亞硝酸鹽的影響

驗期間亞硝酸鹽濃度從第1天到到第26天都在0.17 mg/L以下，最低值在第16天，濃度為0 mg/L。從第26天起亞硝酸鹽濃度開始快速上升，在第46天達到峰值，亞硝酸鹽濃度為（5.18±0.03）mg/L。從第65天開始到第83天快速下降，最低值在第83天，濃度為（0.89±0.02）mg/L。從第84天開始，到試驗結束，亞硝酸鹽一直保持在0.71 mg/L以下，最低值在第 121天，濃度為（0.07±0.01）mg/L。

2.3 生物絮團對硝酸鹽的影響

試驗期間硝酸鹽濃度從第1天到到第28天波動較小，濃度都在0.34 mg/L以下。從第29天起硝酸鹽濃度開始迅速上升，第90天硝酸鹽濃度達到最高為（11.11±0.39）mg/L，到試驗結束，硝酸鹽的濃度趨于平穩(wěn)，濃度在（4.10±0.15）～（6.49±0.23）mg/L之間。

2.4 構建生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)期間pH值的變化

試驗前期，最高值為第12天，pH值為8.05±0.00，最低值在第53天，pH值為7.49±0.02。在第64天，pH值快速降低，達到6.61±0.03。從第65天開始，到第84天一直穩(wěn)定在pH值為7.47±0.01～7.59±0.01之間。試驗進行到第85天開始，pH值呈現穩(wěn)定上升趨勢，最高值在第108天，pH值為8.31±0.02。

2.5 生物絮團微生物多樣性分析

表1為室外生物絮團Alpha生物多樣性分析結果。其Otus數量為831±72.06，在菌群豐度指數指數中，Ace 為 1 180.75±133.94，Chao1 為 1 195.12±124.93；在菌群多樣性指數中，Shannon為 6.16±0.02，Simpson 為 0.96±0.01。

表1 Alpha多樣性分析

2.6 生物絮團微優(yōu)勢菌群分析

由圖5可見，從門的分類水平上來分析，變形菌門（Proteobacteria）所占的比例最多（62.43%±1.26%），藍細菌門（Cyanobacteria）所占的比例最低（4.44%±0.35%）；從科的分類水平上分析，紅桿菌科（Rhodobacteraceae）占的比例最高（22.01%+2.25%），分支桿菌科（Mycobacteriaceae）占的比例最低（1.06+0.40%）（表2）；從屬的分類水平上分析，Candidatus Aquiluna所占的比例最高為8.10%±0.39%，其次是聚球藍細菌屬所占的比例為3.32%±0.31%（圖6）。

表2 室外生物絮團微生物優(yōu)勢科結構

3 討論

3.1 室外生物絮團養(yǎng)殖模式對亞硝酸鹽、氨氮和硝酸鹽含量的影響

從監(jiān)測水體中三氮轉化的變化結果來看，該試驗所構造的生物絮團能很好的促進三氮的轉化。有研究表明，生物絮團起著降低養(yǎng)殖水體中的氮含的作用。生物絮團技術是一種通過向水產養(yǎng)殖系統(tǒng)添加額外碳，并通過添加外部碳源或提高飼料中碳含量來提高水質的技術[11]。在碳氮平衡的條件下，養(yǎng)殖動物排泄物和剩餌產生的氨氮的轉化可通過自養(yǎng)微生物的硝化作用、藻類的光能自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物的同化作用等途徑實現[12]。傳統(tǒng)水產養(yǎng)殖生產中，水體中的氮經常會由于殘餌和養(yǎng)殖動物排泄物而處于較高水平[9]，若此時添加額外碳源，異養(yǎng)微生物就會同化水體無機氮轉化為自身蛋白[8]，同時生物絮團作為食物被水生動物攝食，并能夠凈化養(yǎng)殖水體[9]。總體來說，該技術通過3個方面使對蝦養(yǎng)殖受益：增加產量、降低飼料成本和減少水體中的無機氮[13]。從圖1可以看出，構建的生物絮團系統(tǒng)前期氨氮濃度不高，從第17天開始水體中氨氮濃度急劇上升，最高達到（8.53±0.60）mg/L，這可能由于投喂餌料和凡納濱對蝦排泄物增加造成有機氮過剩，生物絮團量還不足有關。通過補充碳源，維持水體中C/N為15，正常投喂下，在第28天氨氮開始下降，試驗后期，也就是在第67天，即使投餌量不斷增加，氨氮能一直維持在較低的穩(wěn)定值。從圖2可知，亞硝酸鹽濃度在試驗的第26天開始急劇上升，在第64天開始下降，能一直維持在較低值，0.5 mg/L以下。從表3可以得出，水體中硝酸鹽濃度在第26天開始逐步上升，后期穩(wěn)定在 3.70±0.27～11.11±0.39mg/L之間。水體中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽這種承接的變化，可以看出該試驗生物絮團系統(tǒng)除了有異養(yǎng)細菌的同化氨氮，亞硝酸氮外，還存在硝化-反硝化作用，并且對有機氮的轉化起著很大的影響[14]。該試驗在室外養(yǎng)殖池構建生物絮團可以對室外高位池和土塘帶來更加安全的養(yǎng)殖模式。

3.2 室外生物絮團養(yǎng)殖模式對水質微生物菌群的影響

生物絮團能為水體中的微生物提供安全的環(huán)境，以此躲避高級原生動物捕食，同時絮團結構能有效提高微生物汲取營養(yǎng)的效率，因而大部分的海水微生物可以聚集到生物絮團中[15]。從該試驗結果中可以得知，菌群豐度指數中ACE為1 180.75±133.94、Chao1為1 195.12±124.93，菌群多樣性的結果為Shannon 為 6.16±0.02，Simpson 為 0.96±0.01，與于任利華等的報道相似[16]。夏耘等[17]在對草魚養(yǎng)殖中形成的生物絮團的研究中發(fā)現，生物絮團菌群多樣性隨著養(yǎng)殖的時間變化而變化，之后趨于穩(wěn)定的特征。變形菌是細菌中最大的門類，廣泛分布于海洋、江河、海底沉積物中，是凡納濱對蝦養(yǎng)殖中常見優(yōu)勢種類[18]。在該試驗驗中，變形菌門所占的比例也是最大的，其所占的比例為62.43%，這與于任利、夏耘等研究的結果相似[16-17]。在科的分類水平上，紅桿菌科所占的比例最高為22.01%+2.25%，其屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），這與任利華等研究的黃桿菌綱、α-變形菌綱和芽孢桿菌綱是刺參苗種培育池中生物絮團的主要優(yōu)勢菌群的結果相似，Zhao等（2012）利用bioflocs技術分析生物絮團細菌群落結構得出α-變形菌亞綱細菌是優(yōu)勢菌群[19]。異養(yǎng)細菌是生物絮團轉換養(yǎng)殖水體中三氮的主要力量。該試驗中變形菌綱占主要地位，這與過往研究污水處理的結果基本一致[20-22]，其主要的功能是處理污水中的有機物，由此說明生物絮團在養(yǎng)殖水體中起到了調節(jié)水質的作用。該試驗在室外凡納濱對蝦養(yǎng)殖池中所構建的生物絮團，從三氮的轉換能力和水體中的微生物菌群結構都與一些室內的構建結果相似，此結果可以為室外高位池和土塘養(yǎng)殖帶來指導的作用。