趙建偉，姜昊妍，楊 銳，張舒博，王建忠，王春鳳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/吉林省微生態(tài)制劑工程研究中心 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

新城疫 (Newcastle disease，ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus，NDV) 引起的一種高度接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將ND列為法定報告的傳染病，是養(yǎng)雞業(yè)主要預(yù)防的禽傳染病之一[1]。目前針對該病的防控主要依靠疫苗免疫。持續(xù)的監(jiān)控數(shù)據(jù)表明，當(dāng)前我國主要流行的NDV為基因Ⅶ型，而當(dāng)前我國最廣泛使用的疫苗毒株為NDV基因Ⅱ型[2]。雖與流行株同屬一個血清型，但在遺傳距離上相差較遠(yuǎn)，并不能提供理想的免疫保護(hù)效力，受強毒攻擊后排毒現(xiàn)象嚴(yán)重，是導(dǎo)致非典型ND多發(fā)的可能原因之一。在非典型ND多發(fā)生地區(qū)使用基因Ⅶ型疫苗，能有效控制免疫雞群非典型ND的發(fā)生。

因此，研發(fā)與當(dāng)前流行毒株基因型相匹配的新型ND疫苗，是有效防控該病的有效措施。研究表明，F(xiàn)蛋白是NDV感染所必須的蛋白，其在病毒顆粒與宿主融合過程中發(fā)揮重要作用，是刺激宿主產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)的主要抗原成分，由于其在致病性和免疫原性中具有重要意義，已成為研究亞單位疫苗、重組疫苗等新型疫苗的首選抗原[3]，因此本試驗以F蛋白為保護(hù)性抗原開發(fā)亞單位疫苗。

細(xì)菌樣顆粒(bacterium-like particles，BLPs)是一種新型非遺傳修飾型乳酸菌表面展示技術(shù)，外源蛋白可通過乳酸乳球菌肽聚糖錨鉤蛋白( protein anchor，PA)錨定于經(jīng)熱酸處理而得的乳酸乳球菌肽聚糖骨架表面，形成空心表面展示顆粒[4]。肽聚糖 PA 為乳球菌主要自溶素AcmA( N-乙酰葡糖胺糖苷酶的一種，N-acetylmuraminidase) 蛋白C-端結(jié)構(gòu)域[5]。BLPs表面展示系統(tǒng)有著高度的安全性、抗原展示密度大和具有佐劑效應(yīng)等優(yōu)點，在疫苗研制上有著巨大的發(fā)展?jié)摿Γ绕涫窃陴つひ呙绲难邪l(fā)上可望與病毒樣顆粒疫苗一道成為最有前景的基因工程亞單位疫苗形式。

本試驗以基因Ⅶ型NDV的F蛋白為保護(hù)性抗原，立足于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，在體外將PA和F抗原蛋白融合表達(dá)后，加入熱酸預(yù)處理的乳酸乳球菌肽聚糖顆粒中孵育，在PA蛋白的幫助下，即可形成表面展示NDV F蛋白BLPs。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞乳酸乳球菌MG1363購自MOBiTec GmbH,Germany；pEASY克隆載體、BL21( DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于寶生物工程(大連)有限公司；pET-30a(+)載體購自優(yōu)寶生物公司；

1.2 主要試劑質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；T4DNA 連接酶購于NEB 公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ均購于寶生物工程(大連)有限公司；IPTG、硫酸卡那霉素購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG均于購自博奧森生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 F和PA基因片段的擴增與融合根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫中NDV基因Ⅶ型NA-1株(GenBank：DQ659677)F蛋白胞外區(qū)序列和乳酸乳球菌MG1363的AcmA 序列(GenBank：U17696)，設(shè)計特異性PCR引物，F(xiàn)蛋白胞外區(qū)上游引物F-PF，下游引物F-PR。PA序列上游引物PA-PF，下游引物PA-PR。PCR引物設(shè)計詳情見表1,引物由長春庫美公司合成。

提取NA-1株RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴增。以MG1363基因組為模板，進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s;98℃變性10 s，50℃退火5 s，72℃延伸10 s，30個循環(huán)，72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測并進(jìn)行膠回收。將上述得到的F蛋白胞外區(qū)PCR產(chǎn)物和PA蛋白PCR產(chǎn)物為模板，F(xiàn)-PF為上游引物、PA-PR為下游引物，進(jìn)行融合PCR。將融合PCR產(chǎn)物(F-PA)與pEASY克隆載體室溫連接10 min，形成重組質(zhì)粒pEASY-F-PA，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，次日挑取單克隆菌落擴充培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒送檢測序。

1.4 原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-F-PA的構(gòu)建待測序結(jié)果正確后,將pET-30a載體和重組質(zhì)粒pEASY-F-PA分別用XhoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測并進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物測濃度后，使用T4連接酶16℃連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂于含有硫酸卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)。挑選單個菌落擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定，正確的質(zhì)粒即為原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-F-PA。

表1 F、PA融合基因引物序列信息

1.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將pET30a-F-PA原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂于含有硫酸卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)。挑選單個菌落，即形成重組菌pET30a-F-PA-BL21，將重組菌置于5 mL含有硫酸卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，作為母液。次日將母液按照1∶100比例轉(zhuǎn)接到50 mL含有硫酸卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，振蕩約3 h，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h，收集細(xì)菌，利用Western blot技術(shù)鑒定蛋白表達(dá)。取50 mL誘導(dǎo)的菌液，8 000 r/min離心收集菌體，用30 mL PBS洗滌3遍。最后用20 mL PBS進(jìn)行重懸，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞。破碎后10 000 r/min，離心10 min收集細(xì)胞上清與沉淀。沉淀用1 mL PBS重新懸起。將誘導(dǎo)菌體進(jìn)行超聲波破碎，收集的菌體上清和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測其融合蛋白的可溶性。按照Thermo鎳柱蛋白純化說明書進(jìn)行蛋白純化。

1.6 BLPs的制備乳酸乳球菌MG1363在GM17培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)16 h，10 000 r/min，離心15 min，室溫?zé)o菌離心，收集菌體，滅菌水洗滌3次去除培養(yǎng)基，然后用1/5體積的pH=1.0的三氯乙酸重懸，煮沸30 min，10 000 r/min，離心10 min，室溫離心去除酸液，PBS洗滌3次后計數(shù)，以2.5×109為1 U，將其濃度調(diào)整為10 U/mL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 表面展示F蛋白胞外區(qū)BLPs的制備與鑒定從-80℃取出制備好的BLPs，室溫融化，將1 U的BLPs離心后用適量純化后的蛋白重懸，室溫緩慢轉(zhuǎn)動孵育30 min，離心收集沉淀和上清，經(jīng)充分洗滌后制備為表面展示F蛋白胞外區(qū)細(xì)菌樣顆粒F-PA-BLPs，用SDS-PAGE鑒定其結(jié)合效果。

1.8 表面展示F蛋白胞外區(qū)BLPs間接熒光檢測將抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體用PBST按1∶100稀釋后與結(jié)合F-PA重組蛋白的BLPs在37℃搖床共孵育1.5 h，然后12 000 r/min，離心1 min，棄上清,用PBST洗滌3遍。將FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體按1∶500稀釋后孵育結(jié)合后的BLPs顆粒，避光孵育1 h，然后用PBST洗滌3遍，最后用PBS重懸，取適量的菌液涂抹在載玻片上，用抗熒光衰減劑封片后，置于激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 重組蛋白與BLPs的結(jié)合效率將1 U顆粒與分別于純化后40,80,120,130,140 μg F-PA蛋白結(jié)合，通過Western blot和Image J軟件分析其灰度值判斷其結(jié)合效率。

2 結(jié)果

2.1 目的基因F和PA的擴增及融合用特異性引物進(jìn)行PCR擴增目的基因F和PA，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見在1 680,675 bp處有清晰條帶(圖1)，與預(yù)期相符。將F與PA基因進(jìn)行PCR融合，經(jīng)電泳分析可見在1 859 bp處有清晰條帶(圖1)，與預(yù)期相符。

2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-F-PA的構(gòu)建采用XhoⅠ和EcoRⅠ對實驗室保存的原核表達(dá)載體pET30a進(jìn)行雙酶切，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離，在5 388 bp可見一條清晰的線性化載體條帶(圖2A)。將經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切的F-PA片段與pET30a載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-F-PA，分別用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見5 388,1 859 bp左右條帶，與預(yù)期大小相符，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白Western blot檢測重組菌pET30a-F-PA-BL21與空載體對照菌，在IPTG誘導(dǎo)下獲得了表達(dá)。經(jīng)過Western blot分析，重組菌比對照菌明顯多出一條清晰的帶，大小為68 000，與預(yù)期相符；誘導(dǎo)后的重組菌pET30a -F-PA-BL21超聲破碎后，經(jīng)過SDS-PAGE分析，破碎細(xì)菌沉淀在68 000處有明顯的融合蛋白特異性條帶(圖3泳道4)，而破碎細(xì)菌上清在68 000處無特異性條帶(圖3泳道3)表明F-PA蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。

圖1 目的基因的PCR擴增檢測 M1，M2.DL2000 DNA Marker；M3.DL5000 Marker；1.F基因的PCR擴增產(chǎn)物；2.PA基因的PCR擴增產(chǎn)物；3.F-PA基因的PCR擴增產(chǎn)物

圖2 pET30a載體酶切片段 M1.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET30a 載體的XhoⅠ+ EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物；2.pET30a-F-PA重組質(zhì)粒的XhoⅠ+EcoRⅠ雙酶切鑒定

2.4 目的蛋白的純化使用Ni2+柱親和層析法純化目的蛋白，具體操作按照Thermo蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定表明在第3次洗脫后(圖4泳道8)在68 000出現(xiàn)單一條帶，純化效果良好。

2.5 裸露BLPs的透射電鏡檢測經(jīng)透射電鏡觀察可見,未經(jīng)熱酸處理的乳酸乳球菌胞質(zhì)中可見多處深染，并且核區(qū)可見大量核酸(圖5A)；處理后的乳酸乳球菌，即BLPs，可見胞質(zhì)中大量蛋白和核酸已去除(圖5B)，表明BLPs制備成功。

2.6 重組蛋白與BLPs結(jié)合的SDS-PAGE鑒定純化后的F-PA蛋白與BLPs室溫孵育后收集沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)，裸露的BLPs在68 000大小處未出現(xiàn)特異性條帶(圖6泳道1)，結(jié)合F-PA蛋白的BLPs可以在68 000處發(fā)現(xiàn)特異性條帶(圖6泳道3)，表明F-PA可以與BLPs顆粒結(jié)合。

圖3 F-PA蛋白在BL21大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定 M1.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.對照菌；2.重組菌pET30aF-PA-BL21；3.破碎細(xì)菌后上清；4.破碎細(xì)菌后沉淀

圖4 F-PA蛋白純化示意圖 M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.IPTG誘導(dǎo)的原菌液；2.加入平衡液超聲液體；3.超聲后離心上清；4.第1次洗滌；5.第2次洗滌；6.第1次洗脫；7.第2次洗脫；8.第3次洗脫

2.7 重組蛋白F-PA與BLPs結(jié)合間接熒光檢測由圖7可以看出在激光共聚焦熒光顯微鏡下，可以清晰觀察到BLPs表面綠色熒光信號，說面重組蛋白F-PA成功錨定在BLPs上。

2.8 重組蛋白F-PA與BLPs結(jié)合率檢測由圖8A可以看出1 U的BLPs可以與40,80,120,130,140 μg F-PA蛋白發(fā)生結(jié)合，通過Image J軟件分析其灰度(圖8B)，發(fā)現(xiàn)130 μg與140 μg蛋白其灰度值數(shù)值相同(圖8C)，說明1 U的BLPs最大結(jié)合量為130 μg F-PA蛋白。

圖5 BLPs透射電鏡觀察(15 000×) A.未經(jīng)熱處理的乳酸乳球菌；B.熱處理的乳酸乳球菌

圖6 F-PA蛋白與BLPs結(jié)合的SDS-PAGE鑒定 M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.BLPs； 2.純化后的F-PA蛋白；3.BLPs與純化后F-PA蛋白結(jié)合沉淀

圖7 F-PA蛋白在BLPs表面錨定的間接免疫熒光檢測

3 討論

自2000年首次報道了基因Ⅶ型 NDV 在中國大陸的存在以來，基因Ⅶ型NDV逐漸在感染雞群中處于主導(dǎo)地位，因此，越來越多的科研工作者開始研究針對基因Ⅶ型的NDV疫苗。目前，ND防控主要依靠于弱毒疫苗或滅活疫苗聯(lián)合防控，雖然能夠提供良好的保護(hù)力，但也存在著一些弊端。弱毒疫苗雖然能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生持久堅強的免疫力，產(chǎn)生較好的免疫效果，但是存在著持續(xù)帶毒現(xiàn)象，并?？梢砸鹚拗髅庖吡Φ拖耓6]。滅活疫苗相對安全，但其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答較弱、高效價抗體維持時間較短，并且需要佐劑，疫苗佐劑特別是礦物油佐劑引起的副作用比較大。其他類型的疫苗如DNA疫苗雖然有著穩(wěn)定性好、制備簡單、毒力不會返強等優(yōu)點，但也存在著目的蛋白表達(dá)水平較低風(fēng)險，動物試驗發(fā)現(xiàn)其免疫應(yīng)答較弱[7-8]。袁乾亮等[9]利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)與病毒樣顆粒(VLPs)形成的NDV VLPs亞單位疫苗具有良好的免疫原性，并且相比于商品滅活苗具有更明顯的免疫保護(hù)效力，可顯著降低病毒的組織載量和排毒量，亞單位疫苗在防治ND方面具有很好的應(yīng)用前景。

圖8 F-PA蛋白與BLPs顆粒結(jié)合效率檢測 A.Western blot(M.蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的F-PA蛋白；2.BLPs；3～7.1 U的BLPs分別與40,80,120,130,140 μg純化后的F-PA蛋白結(jié)合后沉淀);B.Image J軟件分析其灰度；C.灰度值柱形圖

NDV主要通過呼吸道和消化道感染，因此這些器官的黏膜成為抗感染的第一道防線，有效的黏膜免疫可以阻止NDV的吸附和侵入，阻止其進(jìn)一步感染。此外疫苗通過呼吸道黏膜免疫雛雞可以不受母源抗體的干擾，能夠產(chǎn)生分泌性IgA，如果機體的呼吸道和消化道有一定濃度的分泌性IgA，則可以有效地抵抗NDV的侵襲和感染，因此病毒特異性IgA抗體水平高低也是作為評價機體免疫水平的重要標(biāo)志。開發(fā)ND亞單位黏膜疫苗對ND的防治具有重要意義。選擇一個對雞呼吸道和消化道具有較好的親和性、能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的黏膜免疫的疫苗至關(guān)重要。BLPs大小為1 μm，正好是黏膜表面M細(xì)胞攝取外源抗原的理想大小，可被有效的轉(zhuǎn)運至抗原遞呈細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的黏膜免疫反應(yīng)[10]。因此，BLPs是一種理想的黏膜疫苗形式。國外已經(jīng)有以BLPs為基礎(chǔ)研究黏膜疫苗，并取得良好的效果。RIGTER 等[11]用表面展示呼吸道合胞體病毒(RSV)F蛋白的BLP-RSVF通過黏膜免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)出比滅活疫苗更高的中和抗體，受強毒攻擊后可以顯著降低肺臟病毒載量，具有良好的保護(hù)效力，已經(jīng)成為預(yù)防RSV安全而有效的候選疫苗，并獲得了英國藥物許可。

作為表面展示系統(tǒng)，其表面展示的目的蛋白量是關(guān)鍵。PA作為BLPs重要組成部分，其錨定活性直接決定了外源蛋白與BLPs的結(jié)合效率，國外報道大都集中于乳酸乳球菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)研究[12]。應(yīng)用自身的宿主菌表達(dá)PA確實能夠提高PA活性，但是由于乳酸乳球菌外源基因轉(zhuǎn)化表達(dá)困難且蛋白表達(dá)產(chǎn)量較低。因此我們選擇了操作簡單、技術(shù)成熟、目的蛋白表達(dá)量大的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外表達(dá)F-PA蛋白。此外2016年，沈俊俊等[13]用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)NDV基因Ⅶ型F蛋白，同時將純化后F蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)蛋白有著良好的免疫原性，能夠產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答。因此大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成為首選表達(dá)系統(tǒng)。BLPs的質(zhì)量也直接影響著抗原的展示效率。三氯乙酸常用于乳酸菌肽聚糖提純，它可以較好地去除乳酸菌表面的磷酸壁，磷酸壁可以跨越質(zhì)膜，穿透肽聚糖層。去除磷酸壁相當(dāng)于在菌體開孔，可以在保證菌體形態(tài)的情況下，使菌體里面的內(nèi)容物流出。但是從透射電鏡觀察BLPs發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)去除效率不高，可能的原因是其三氯乙酸使菌體蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[14]，隨著蛋白質(zhì)聚集量增大，很難從空洞中流出。因此可以觀察到乳酸菌蛋白質(zhì)殘留。據(jù)國外報道稱，pH值為1.0是BLPs制備成功的關(guān)鍵[15]。我們下一步會在pH為1.0的情況下更換不同類型的酸，來優(yōu)化BLPs的制備。

綜上所述，本試驗以目前我國流行的基因Ⅶ型NDV NA-1株為研究對象，用傳統(tǒng)的原核表達(dá)系統(tǒng)制備含有F主要結(jié)構(gòu)蛋白的BLPs；選擇與當(dāng)前流行株相匹配的基因型，避免了傳統(tǒng)疫苗出現(xiàn)的病毒載量高、排毒反應(yīng)強烈等免疫偏差影響;因此，該NDV F蛋白 BLPs可作為疫苗候選株,為防控ND提供新的策略。