李常紅，趙寒冬， 程云云，郝林琳 ，滕肇慧

(1.白城師范學院 生命科學學院，吉林 白城 137000；2.長春農(nóng)業(yè)博覽園,吉林 長春 130117；3.吉林大學 動物科學學院,吉林 長春 130062；4.大連摩格生物科技有限公司，遼寧 大連 116023)

動物的生長是一個復雜的生物代謝過程，受多種因素的影響，包括環(huán)境變化、營養(yǎng)供給、遺傳基因、激素調(diào)節(jié)等。各種因素對生長的調(diào)節(jié)最終是通過下丘腦-垂體-胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)生長軸來調(diào)控實現(xiàn)的[1-3]。據(jù)報道GH是一種由垂體合成分泌的單一肽類激素，其呈脈沖式釋放后主要與肝細胞表面的GHR 結(jié)合，經(jīng)過JAK2/STAT5途徑激活下游信號傳導和靶基因轉(zhuǎn)錄[4]，產(chǎn)生IGF1。IGF1與IGF1R結(jié)合后通過多種信號通路而發(fā)揮促進生長和調(diào)節(jié)代謝的作用。

microRNAs (miRNAs)作為一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達的非編碼小RNA分子，在動物體內(nèi)主要是通過靶向mRNA 的3′UTR 發(fā)揮作用。它們通過這種方式參與調(diào)控大量生物功能和進程，如發(fā)育、分化、代謝、生長、增殖和細胞凋亡，近年來它們成為分子和細胞生物學領(lǐng)域研究的熱點。miRNAs的研究在各領(lǐng)域都取得了重要進展，人們對miRNAs的研究也更加深入。哺乳動物miRNAs的研究已經(jīng)涉及多個組織/器官，關(guān)于垂體miRNAs的研究也取得了一些重要進展。

研究表明，大量非編碼RNAs參與調(diào)控IGFs的表達進而影響機體生理和病理效應。LIU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，出生后70 d豬肝臟中IGF1的表達水平是胚胎70 d時的26.6倍，并從miRNA調(diào)控方面探討了豬不同發(fā)育階段肝源性IGF1差異表達的原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-18b和miR-130b-3p可能是導致IGF1在不同發(fā)育階段肝臟中表達差異的部分原因。KAMRAN等[6]證實在青少年時期，miR-29的高表達降低了多種促進生長基因(包括肝臟IGF-1)的表達，從而導致生長發(fā)育緩慢。IGF1是肝細胞癌中的一個hub基因，也是肝癌組織與正常組織相比上調(diào)最多的基因之一，miR-379通過靶向其受體基因IGF1R并抑制其表達，促進肝癌細胞的凋亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-511通過靶向豬IGF1基因，降低IGF1表達水平及相關(guān)通路因子(MAPK/ERK及PI3K/Akt)的表達，并抑制PK-15細胞的增殖、促進其凋亡[8]。大量研究表明垂體中miRNAs與動物生長調(diào)控密切相關(guān)。ZHANG等[9]通過microarray檢測了大鼠垂體中的miRNAs，其中miR-709在大鼠垂體中高表達且可能參與生長調(diào)控過程。因此，本試驗旨在明確垂體miR-709與關(guān)鍵生長調(diào)控因子IGF1的靶向關(guān)系及對IGF1基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系所用HEK-293T細胞系由吉林大學李占軍教授饋贈；大鼠肝癌細胞H4-II-E為本試驗室保存細胞系。

1.2 菌株及載體所用E.coli感受態(tài)細胞為DH5α，所用載體為psi-CHECKTM-2雙熒光素酶報告基因表達載體，由吉林大學動物科學學院歐陽紅生課題組饋贈。

1.3 主要試驗儀器所用主要試驗儀器列表見表1所示。

表1 主要試驗儀器

1.4 主要試劑、耗材限制性內(nèi)切酶 NotⅠ(TaKaRa)、XhoⅠ(TaKaRa)，T4DNA 連接酶(TaKaRa)， 酵母提取物(OXOID)，胰蛋白胨(OXOID)，瓊脂粉(OXOID)，NaCl(北京化工)，氨芐青霉素，F(xiàn)uGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑(Promega)，F(xiàn)12K 細胞培養(yǎng)基(Gibco)，Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(MCE)，0.25% 胰酶(Gibco)，PBS(博士德)，谷氨酰胺(Gibco)，青鏈霉素雙抗(Gibco)， 丙烯酰胺(北京化工)，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(北京化工)，過硫酸銨(北京化工)，鹽酸(北京化工)，TEMED (Biosharp)， 甲醇(北京化工)，蛋白酶抑制劑 Cocktail(MCE)，磷酸酶抑制劑Cocktail (MCE)，無水乙醇(北京化工)，雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(Promega)，凝膠回收試劑盒(天根)，Trizol(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量試劑盒(TaKaRa)。試驗所用離心管、移液吸頭、細胞培養(yǎng)皿及細胞培養(yǎng)板等耗材均為Biosharp品牌。

1.5 細胞培養(yǎng)基配制H4-II-E細胞及HEK-293T細胞培養(yǎng)基配制體系，見表2。

表2 H4-II-E細胞及HEK-293T細胞培養(yǎng)基配方

1.6 miRNAs合成本試驗所研究的miR-709 mimic由蘇州吉瑪生物公司合成，序列見表3，其中包括所用到的mimic的陰性對照(NC)。

表3 miR-709及NC的核苷酸序列

1.7 靶基因預測采用在線軟件TargetScan (http://www.targetscan.org) 對miR-709的潛在靶基因進行預測，采用mfold (http://unafold.rna.albany.edu)對miR-709與IGF1基因3′UTR互補配對形成的RNA二級結(jié)構(gòu)進行預測。

1.8 載體構(gòu)建為了檢測目標miRNA與潛在靶基因的靶關(guān)系，本試驗構(gòu)建了豬IGF1基因野生型(WT)、突變型(MUT)及刪除型(DEL)3′UTR雙熒光素酶報告基因表達載體。首先合成了IGF1基因的3′UTR序列及對應的miR-709結(jié)合靶點突變及刪除的3′UTR序列，然后將其插入到psiCHECKTM-2的XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點中間形成IGF1-3′UTR-WT、IGF1-3′UTR-MUT和IGF1-3′UTR-DEL重組載體。

載體構(gòu)建過程簡述如下：psiCHECKTM-2載體經(jīng) XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切體系見表4。采用凝膠回收試劑盒進行回收，并分別用 T4連接酶與合成的IGF1基因內(nèi)3′UTR片段在16℃條件下過夜連接，連接體系見表5。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑取單菌落，采用菌液 PCR 法和測序法對連接產(chǎn)物進行鑒定。

1.9 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取將轉(zhuǎn)化了IGF1基因3′UTR的重組載體的大腸桿菌于37℃擴大培養(yǎng)后，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.10 細胞轉(zhuǎn)染本試驗中的細胞轉(zhuǎn)染包括miRNA的轉(zhuǎn)染、miRNA與雙熒光素酶表達載體的共轉(zhuǎn)染。為了驗證目標miR-709與IGF1基因的靶關(guān)系，將miRNAs與構(gòu)建好的雙熒光素酶表達載體共同轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞中，48 h后通過檢測螢火蟲熒光素酶及海參熒光素酶的活性來確定miR-709與IGF1基因的靶關(guān)系；為了檢測miR-709對IGF1表達的影響，將miR-709轉(zhuǎn)染至大鼠肝癌細胞H4-II-E中，48 h后收集細胞進行總RNA及總蛋白質(zhì)的提取。

表4 載體雙酶切體系

表5 目的片段與載體連接體系

1.11 雙熒光素酶活性檢測提前1 d將 4×104cells/well的HEK-293T 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，細胞轉(zhuǎn)染之前使用100 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基漂洗細胞1次，并加入 80 μL DMEM培養(yǎng)基預處理細胞2 h。psiCHECKTM-2重組質(zhì)粒與miRNAs分別共轉(zhuǎn)染 HEK-293T 細胞，48 h后按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書分別于多功能酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶活性及海腎螢光素酶的活性。

1.12 總RNA提取本試驗采用Trizol法進行RNA的提取，即將收集的轉(zhuǎn)染后的細胞加入至500～1 000 μL Trizol中，室溫裂解10 min后，加入0.2倍Trizol體積的氯仿進行萃取顛倒混勻，室溫靜置10 min后于4℃離心10 min，取上清加入0.5倍Trizol體積的異丙醇進行RNA的沉淀，室溫靜置5 min后于4℃離心10 min，棄上清,用75%的酒精洗滌沉淀，晾干，加入40 μL無RNA酶 ddH2O 進行溶解，測定濃度后對其進行反轉(zhuǎn)錄。

1.13 RNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR對于miR-709，采用特異性頸環(huán)結(jié)構(gòu)引物RT primer(表6 )對所得總RNA進行反轉(zhuǎn)錄；對于mRNA，則采用Oligo dT反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析，β-actin和U6分別作為IGF1和miR-709的內(nèi)參基因。

以反轉(zhuǎn)錄得到的的 cDNA 為模板，以miR-709、U6、IGF1及β-actin(表6)為引物，以 SYBR?Green為染料，進行實時熒光定量PCR。根據(jù) Power SYBR?Green PCR 說明書加反應體系：cDNA2 μL，2× Master Mix 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，57℃ 15 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)，在72℃采集熒光信號；溶解曲線程序：55℃ 30 s，81個循環(huán)。

表6 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR引物信息

1.14 總蛋白質(zhì)提取及濃度測定細胞轉(zhuǎn)染48 h后采用Western及IP裂解液進行裂解，將細胞碎片離心后取上清，采用BCA試劑盒對所提取的總蛋白質(zhì)濃度進行測定。

1.15 Western blot檢測在15%濃度SDS-PAGE分離膠上對總蛋白進行分離，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉，然后于4℃進行IGF1和β-actin一抗過夜孵育及室溫進行辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育2 h后在多功能分子成像系統(tǒng)中進行成像。

1.16 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，對于組間miR-709及IGF1表達水平差異采用單因素方差(ANOVA)分析，P<0.05為差異顯著(*)，P<0.01為差異極顯著(**)。

2 結(jié)果

2.1 miRNA mimic轉(zhuǎn)染效率及miR-709表達量檢測為了檢測miRNA在細胞中的轉(zhuǎn)染效率，我們將FAM標記的NC mimic轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞中，12 h后在熒光顯微鏡下對其轉(zhuǎn)染效率進行檢測，結(jié)果顯示，miRNA在細胞中的轉(zhuǎn)染效率較高(圖1A)，能夠滿足試驗要求。然后為了進一步確定miR-709在大鼠肝臟細胞H4-II-E中的轉(zhuǎn)染效率，本試驗在轉(zhuǎn)染miR-709 mimic及NC mimic 后采用qRT-PCR法對miR-709的表達量進行檢測，結(jié)果顯示miR-709 mimic組細胞中miR-709的表達量極顯著高于對照組(圖1B)(P<0.01)。

2.2 miR-709與IGF1基因的靶關(guān)系鑒定基于生物信息學分析，miR-709的種子序列與IGF1基因3′UTR互補(圖2A)，且結(jié)合形成較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)(圖2B)。IGF1基因3′UTR的雙熒光素酶重組表達載體(IGF1-3′UTR-WT、IGF1-3′UTR-MUT和IGF1-3′UTR-DEL)與miR-709 或NC轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞后48 h，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒分別對螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的活性進行檢測，相對熒光素酶活性結(jié)果表明miR-709直接靶向IGF1基因(圖2C)。

2.3 miR-709對IGF1基因表達量的影響明確miR-709靶向IGF1基因后，本試驗進一步將miR-709轉(zhuǎn)染至大鼠肝臟細胞H4-II-E中，48 h后檢測IGF1表達量。qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果表明miR-709顯著抑制了IGF1在RNA(圖3A)(P<05)及蛋白質(zhì)的表達水平(圖3B,C)(P<0.05)。

圖1 miRNA轉(zhuǎn)染效率及miR-709表達量檢測 A.miRNA在HEK-293T細胞中的轉(zhuǎn)染效率檢測；B.在H4-II-E細胞中轉(zhuǎn)染miR-709 mimic后miR-709的表達量檢測

圖2 miR-709靶向IGF1基因 A.miR-709種子序列與IGF1基因3′UTR互補配對情況；B.miR-709與IGF1基因3′UTR形成的RNA二級結(jié)構(gòu)；C.miR-709靶向IGF1基因的雙熒光素酶活性檢測結(jié)果

3 討論

在動物生長調(diào)控過程中，垂體發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其作用的垂體-IGF1-靶器官生長軸中IGF1是關(guān)鍵的中心環(huán)節(jié)。在血液循環(huán)和局部組織中，絕大部分IGF1由肝臟提供，研究人員證實過表達IGF1的小鼠與野生型小鼠相比各器官質(zhì)量顯著增加，并表明IGF1參與到機體出生至青春期階段的生長，且引起各器官體積成比例地增大[10]。反之，缺乏IGF1則會導致病人身材相對矮小[11]，而這種現(xiàn)象可通過長期用IGF1治療明顯恢復[12]。此外，缺乏IGF1的胎鼠有短肢侏儒癥，礦化延遲，慢性粒細胞凋亡增加的現(xiàn)象[13]，表明IGF1的促生長作用貫穿出生前及出生后，也足以見得IGF1在動物生長中的重要性[14]。

miRNA是一類長度約19～24 nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因的3′UTR部分或完全互補，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達的作用。研究表明miRNA與動物生長密切相關(guān)，表現(xiàn)為在肌肉發(fā)育的各個環(huán)節(jié)具有重要的調(diào)節(jié)作用，以及涉及骨骼肌衛(wèi)星細胞的遷移、增殖、分化和凋亡，成肌細胞的分化和肌管融合，肌纖維類型轉(zhuǎn)換等多個生物學過程[15]。 目前已經(jīng)在牛、豬、羊等家畜中鑒定到多個參與骨骼肌發(fā)育的 miRNAs[16-17]。近年來，組織/器官間的信息交流也逐漸成為研究熱點，例如非編碼RNA可能通過外泌體等介質(zhì)進行組織間的調(diào)控[18-19]。隨著處于生長軸中心的垂體組織中miRNAs逐漸被挖掘，垂體miRNA的功能也相繼被報道[20-21]。miRNA 在細胞之間以及組織之間的表達具有特異性。有研究證實miRNA 在某一組織中的特異高表達往往與該組織的一些典型功能相關(guān)。其中大鼠垂體中miR-7是表達量最高的miRNA，其可能參與到FSH的表達調(diào)控，與動物繁殖性能相關(guān)[22]。而目前對于大鼠垂體中第二高表達的miR-709的功能研究較少，基于ZHANG等[9]的研究結(jié)果可以推斷miR-709可能參與動物的生長調(diào)控。因此本試驗基于生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-709可能靶向關(guān)鍵生長因子IGF1基因。

本試驗通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)及IGF1表達量檢測證實了miR-709與IGF1基因的靶向關(guān)系及miR-709對IGF1表達的抑制作用。本試驗結(jié)果表明H4-II-E細胞中表達較低含量的IGF1，猜測原因可能是此細胞為大鼠肝癌細胞，屬于肝臟受損細胞，因細胞功能缺失而導致的IGF1表達量較低。miR-709是在大鼠垂體組織中高表達的miRNA，IGF1在垂體GH的合成中扮演的是負反饋調(diào)控因子。因此，推測miR-709在調(diào)控垂體GH-IGF1之間發(fā)揮的可能是平衡的作用，即維持垂體GH表達的穩(wěn)定性。