劉笑凝，焦智慧，馬亞軍，張千振，徐嘉元，樸晨曦，張建濤，王洪斌

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物普通疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和脂類(lèi)等生物大分子合成的主要場(chǎng)所，在蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾、運(yùn)輸和折疊過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[1]。當(dāng)受到內(nèi)外環(huán)境刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境發(fā)生改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)大量蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞一系列的適應(yīng)性反應(yīng)，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[2]。GRP78蛋白是熱休克蛋白70家族成員，具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。在生理狀態(tài)下，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的GRP78蛋白同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上3類(lèi)跨膜蛋白(ATF6、PERK和IRE1)結(jié)合處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78蛋白會(huì)感受并結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白形成復(fù)合物，同時(shí)與上述3類(lèi)感受蛋白解離，激活3條ERS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路ATF6、PERK和IRE1[3]。適度的ERS有助于機(jī)體應(yīng)對(duì)微環(huán)境改變，但長(zhǎng)期的ERS會(huì)激活下游ATF4-CHOP等凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在肝切除術(shù)和肝移植術(shù)這類(lèi)需要阻斷肝蒂血流的復(fù)雜肝臟手術(shù)中，原本缺血時(shí)受損的肝細(xì)胞，在血供恢復(fù)后損傷非但沒(méi)有減輕，反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象，稱(chēng)為肝臟缺血再灌注 (ischemia-reperfusion,I/R)損傷[4-5]。由于肝臟I/R會(huì)進(jìn)一步加劇肝臟的額外損傷，所以對(duì)于如何有效減輕手術(shù)過(guò)程中的肝臟I/R損傷成為了臨床上亟待解決的問(wèn)題。近年的大量研究表明，造成肝臟I/R損傷的主要損傷因子如能量代謝紊亂、鈣超載以及氧化應(yīng)激都會(huì)激活ERS，這表明ERS在肝臟I/R損傷中發(fā)揮了重要作用[6]。長(zhǎng)時(shí)間的ERS會(huì)嚴(yán)重影響肝細(xì)胞的功能，甚至誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡加劇肝臟損傷。因此若對(duì)ERS信號(hào)傳導(dǎo)途徑加以干預(yù)，或許是減輕肝臟I/R損傷的有效策略。

干細(xì)胞由于其特殊的多向分化潛能和自我復(fù)制能力，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)除了其潛在的分化功能外，已被證實(shí)可在外傷、缺血、炎癥等病理過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用[7]。以往研究表明干細(xì)胞主要靠分化作用和旁分泌作用發(fā)揮其生理保護(hù)效應(yīng)，而近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在移植靶點(diǎn)的移植率和存活率均較低，所以現(xiàn)在傾向于認(rèn)為干細(xì)胞的作用機(jī)制主要依靠其旁分泌效應(yīng)，通過(guò)釋放可溶性分子減輕損傷和促進(jìn)組織的再生恢復(fù)[8]。另外相對(duì)于傳統(tǒng)的干細(xì)胞移植，通過(guò)處理間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌產(chǎn)物提取的條件培養(yǎng)液在臨床使用上具有安全和易運(yùn)輸保存的優(yōu)點(diǎn)[9]。然而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell condition medium，ADSC-CM)能否抑制肝臟I/R損傷所致的 ERS，從而減輕肝臟的損傷，尚且需要進(jìn)一步探究。

腹腔鏡手術(shù)具有創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復(fù)快和并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)，在臨床肝臟手術(shù)中應(yīng)用廣泛[10]。本試驗(yàn)應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)建立ADSC-CM干預(yù)小型豬肝臟I/R合并部分肝切除損傷模型，觀察ADSC-CM干預(yù)后肝臟組織病理學(xué)以及肝細(xì)胞ERS各指標(biāo)的變化情況，探討ADSC-CM對(duì)小型豬肝臟I/R合并部分肝切除損傷模型的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 4～6月齡廣西巴馬小型豬24頭，體質(zhì)量20～30 kg，相同條件下飼養(yǎng)1個(gè)月，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查確認(rèn)健康后用于試驗(yàn)。

1.1.2試驗(yàn)細(xì)胞 試驗(yàn)過(guò)程中所用小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室腹腔鏡課題組提供，已經(jīng)誘導(dǎo)成肝、成脂、成骨分化鑒定多向分化能力，細(xì)胞流式鑒定表面分子標(biāo)記物，確定為小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞[11]。

1.1.3主要儀器與試劑 高清醫(yī)用內(nèi)窺鏡攝像系統(tǒng)、醫(yī)用內(nèi)窺鏡冷光源均購(gòu)自深圳神州醫(yī)療設(shè)備有限公司；腹腔鏡手術(shù)基本設(shè)備、醫(yī)用CO2氣腹機(jī)、醫(yī)用高頻電刀USE-30型均購(gòu)自O(shè)lympus公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler480 Ⅱ購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷儀器公司；改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,Low Glucose,L-DMEM)購(gòu)自美國(guó)Inyitrogen生命技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)CLARK公司；小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)外科教研室配制；丙泊酚注射液購(gòu)自西安力邦制藥有限公司；硫酸阿托品注射液購(gòu)自新鄉(xiāng)市常樂(lè)制藥有限責(zé)任公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ADSC-CM的制備 取P4脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10% FBS和1%青鏈霉素以及1%谷氨酰胺的L-DMEM培養(yǎng)細(xì)胞至密度80%～90%，換用新鮮無(wú)血清L-DMEM，饑餓培養(yǎng)48 h;收集上清至50 mL無(wú)菌離心管中，1 500 r/ min離心10 min，吸取上清至新的無(wú)菌離心管中，以0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，吸取過(guò)濾后的ADSC-CM于3 000超濾離心管中，5 000 r/min 4℃離心40 min，-80℃保存ADSC-CM濃縮液，使用時(shí)37℃預(yù)溫。

1.2.2試驗(yàn)分組與手術(shù)建模 將24頭小型豬隨機(jī)分為模型組、基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)照組(DMEM組)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液組(ADSC-CM組)和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組(ADSCs組)，每組6頭。術(shù)前禁食24 h，禁水12 h。參照文獻(xiàn) [11]，在腹腔鏡下進(jìn)行右半肝缺血60 min合并左半肝切除手術(shù)。模型組、基礎(chǔ)培養(yǎng)基組和條件培養(yǎng)液組于斷面邊緣1 cm左右分點(diǎn)分別注射等量生理鹽水、基礎(chǔ)培養(yǎng)基及條件培養(yǎng)液。檢查斷面有無(wú)出血，清洗腹腔后將離斷肝組織裝袋取出，縫合腹壁，碘酊消毒，術(shù)后加強(qiáng)護(hù)理。各組于術(shù)前、術(shù)后1，3，7 d經(jīng)腹腔鏡手術(shù)取肝臟組織，分為2份，一份用4%甲醛固定，另一份-80℃保存待檢。

1.2.3肝臟組織HE切片觀察 取各組采集的經(jīng)4%甲醛固定的小塊肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋處理后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)變化。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)ERS各指標(biāo)基因表達(dá)的變化 總RNA的提取及cDNA的合成：取各組凍存組織加入Trizol試劑研磨，經(jīng)氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇漂洗沉淀后，將獲取的總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物的設(shè)計(jì)和合成：參照 NCBI中豬基因序列，采用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了GRP78、PERK、IRE1、ATF6、ATF4和CHOP特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，熒光染料混合物10 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；融解分析95℃ 5 s，60℃ 1 min,升溫至95℃；50℃ 30 s降溫。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各因子相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息

1.3 數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行方差處理，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織病理學(xué)觀察由圖1可知，模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組術(shù)前組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈索狀規(guī)則排列，無(wú)壞死跡象。模型組和DMEM組在術(shù)后1，3和7 d可見(jiàn)不同程度肝臟組織損傷：肝細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞腫脹嚴(yán)重，多見(jiàn)空泡變性，并存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死性病變，其中以術(shù)后1，3 d損傷較為嚴(yán)重。與上述2組相比，ADSC-CM組和ADSCs組各時(shí)間點(diǎn)的肝細(xì)胞排列較規(guī)則，基本呈索狀，且炎癥浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死明顯減少。

圖1 肝臟組織病理學(xué)變化(200×) A,B,C,D.分別為模型組術(shù)前、術(shù)后1，3，7 d的HE結(jié)果；E,F,G,H.分別為DMEM組術(shù)前、術(shù)后1，3，7 d的HE結(jié)果；I,J,K,L.分別為ADSCs組術(shù)前、術(shù)后1，3，7 d的HE結(jié)果；M,N,O,P.分別為ADSCs-CM組術(shù)前、術(shù)后1，3，7 d的HE結(jié)果

2.2 肝臟ERS信號(hào)分子的mRNA表達(dá)水平

2.2.1GRP78 由表2知，GRP78基因在模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組中的mRNA表達(dá)水平在時(shí)間上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均于術(shù)后1 d達(dá)到峰值，相比于術(shù)前差異極顯著(P<0.01)。模型組的GRP78基因在術(shù)后1,3 d的mRNA表達(dá)水平均極顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.01)，而與DMEM組在上述時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異；ADSC-CM組的GRP78基因在術(shù)后1,3 d的mRNA表達(dá)水平均極顯著低于DMEM組(P<0.01)，而與ADSCs組在上述時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。

2.2.2ATF6 由表3可知，ATF6基因在模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組中的mRNA表達(dá)水平在時(shí)間上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均于術(shù)后1 d達(dá)到峰值，相比于術(shù)前差異極顯著(P<0.01)。模型組的ATF6基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.01)，在術(shù)后3 d顯著高于ADSCs組(P<0.05)，而與DMEM組無(wú)顯著性差異；ADSC-CM組的ATF6基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著低DMEM組(P<0.01)，在術(shù)后3 d顯著低于DMEM組(P<0.05)，而與ADSCs組在上述時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。

表2 GRP78基因mRNA表達(dá)變化

表3 ATF6基因mRNA表達(dá)變化

2.2.3IRE1 由表4可知，IRE1基因在模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組中的mRNA表達(dá)水平在時(shí)間上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均于術(shù)后1 d達(dá)到峰值，相比于術(shù)前差異極顯著(P<0.01)。模型組的IRE1基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.01)，而與DMEM組無(wú)顯著性差異；ADSC-CM組的IRE1基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著低DMEM組(P<0.01)，而與ADSCs組無(wú)顯著性差異。

表4 IRE1基因mRNA表達(dá)變化

2.2.4PERK 由表5可知， PERK基因在模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組中的mRNA表達(dá)水平在時(shí)間上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均于術(shù)后1 d達(dá)到峰值，相比于術(shù)前差異極顯著(P<0.01)。模型組的PERK基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.01)，在術(shù)后3 d顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.05)，而與DMEM組在上述時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異；ADSC-CM組的PERK基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著低DMEM組(P<0.01)，而與ADSCs組無(wú)顯著性差異。

表5 PERK基因mRNA表達(dá)變化

2.2.5ATF4 由表6可知，ATF4基因在模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組中的mRNA表達(dá)水平在時(shí)間上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均于術(shù)后1 d達(dá)到峰值，相比于術(shù)前差異極顯著(P<0.01)。模型組的ATF4基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.01)，在術(shù)后3 d顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.05)，而與DMEM組在上述時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異；ADSC-CM組的ATF4基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著低DMEM組(P<0.01)，在術(shù)后3 d顯著低DMEM組(P<0.05)，而與ADSCs組無(wú)顯著性差異。

表6 ATF4基因mRNA表達(dá)變化

2.2.6CHOP 由表7可知，CHOP基因在模型組、DMEM組、ADSC-CM組和ADSCs組中的mRNA表達(dá)水平在時(shí)間上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均于術(shù)后1 d達(dá)到峰值，相比于術(shù)前差異極顯著(P<0.01)。模型組的CHOP基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著高于ADSC-CM組和ADSCs組(P<0.01)，而與DMEM組無(wú)顯著性差異；ADSC-CM組的CHOP基因在術(shù)后1 d的mRNA表達(dá)水平極顯著低DMEM組(P<0.01)，而與ADSCs組無(wú)顯著性差異。

表7 CHOP基因mRNA表達(dá)變化

3 討論

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種具有自我更新以及多向分化潛能的干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)中獲得廣泛應(yīng)用。然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植入機(jī)體后存活時(shí)間短，但其會(huì)分泌多種細(xì)胞外囊泡和可溶性因子，以此調(diào)節(jié)作用位點(diǎn)的局部微環(huán)境，促進(jìn)組織的修復(fù)再生[12-13]。來(lái)源于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的ADSC-CM，不僅有抑制凋亡、誘導(dǎo)血管再生和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，而且相對(duì)于干細(xì)胞來(lái)說(shuō)沒(méi)有排斥反應(yīng)和致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)[9,14]。FOURASCNEV等[15]通過(guò)阻斷左側(cè)葉和中葉60 min，缺血結(jié)束后結(jié)扎并切除右側(cè)正中葉、右側(cè)外側(cè)葉和尾狀葉建立大鼠缺血再灌注合并半肝切除模型，術(shù)后給予人肝臟來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液(MSC-CM)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清和組織樣本中治療組ALT和AST水平顯著低于對(duì)照組，表明MSC-CM能有效減少肝臟組織的損傷，促進(jìn)肝臟組織的再生。MASOUMEH等[16]通過(guò)閉塞大腦中動(dòng)脈(MCAO)建立大鼠局灶性腦缺血模型，并給予人羊膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療，發(fā)現(xiàn)治療組的梗塞體積、腦水腫和伊文思藍(lán)滲透率顯著低于對(duì)照組，改善了腦缺血急性期的病理效應(yīng)。大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液可在多種疾病中發(fā)揮作用[17]，而ADSC-CM更加容易獲得和制備的特性備受人們關(guān)注。為探究ADSC-CM對(duì)肝臟I/R以及手術(shù)切除損傷的保護(hù)作用，本試驗(yàn)建立了小型豬肝臟I/R合并肝臟部分切除模型，并于切除后肝臟局部注射ADSC-CM干預(yù)治療。對(duì)術(shù)前及術(shù)后1，3和7 d的肝臟組織進(jìn)行HE染色觀察。組織學(xué)結(jié)果顯示，ADSC-CM干預(yù)后肝臟結(jié)構(gòu)得以改善，肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和空泡變性減少，證明ADSC-CM可以有效減輕肝I/R和切除后的肝組織損傷。

肝臟手術(shù)中的I/R過(guò)程會(huì)加劇組織的損傷，目前對(duì)于肝臟I/R方面進(jìn)行了大量的研究。一般認(rèn)為能量代謝紊亂是造成IRI的主要原因，隨后活性氧(ROS)、促炎細(xì)胞因子以及鈣超載的產(chǎn)生加重了I/R損傷的發(fā)生，而這些損傷因子均可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能障礙，引發(fā)ERS并促進(jìn)ERS介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)[18-19]，這說(shuō)明ERS在I/R導(dǎo)致的組織損傷中發(fā)揮重要作用。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是一種伴侶熱休克蛋白,其存在于真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與蛋白質(zhì)的裝配、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持等多個(gè)生理過(guò)程[20]。因此GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的標(biāo)志物，其表達(dá)量的上升表明ERS的發(fā)生[20-21]。石印青等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟70%缺血模型中，I/R損傷與GRP78的表達(dá)量呈正相關(guān)趨勢(shì)。LI等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在小型豬肝臟I/R合并部分肝切除模型中，GRP78于再灌注即刻和1 d的表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)通路信號(hào)分子表達(dá)量與GRP78趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明I/R損傷能誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，并可以通過(guò)檢測(cè)其標(biāo)志物GRP78表達(dá)量判斷ERS發(fā)生與否和輕重程度。在本試驗(yàn)中，各組術(shù)后1，3 d 的GRP78 mRNA表達(dá)水平顯著均高于術(shù)前，證明該模型中發(fā)生了ERS，與其他人的研究結(jié)果基本一致。CHI等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可以通過(guò)調(diào)節(jié)UPR反應(yīng)顯著降低GRP78標(biāo)志蛋白的表達(dá)，以此改善改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能癥狀。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后1,3 d時(shí)ADSC-CM組和ADSCs組的GRP78表達(dá)水平顯著均低于模型組，而兩者間無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明ADSC-CM能顯著抑制術(shù)后的GRP78 mRNA的表達(dá)和ERS，減輕手術(shù)中的I/R損傷。

ERS也被稱(chēng)為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，UPR是一種細(xì)胞為適應(yīng)體內(nèi)微環(huán)境的改變而出現(xiàn)的自我保護(hù)機(jī)制[24]。在適應(yīng)期UPR發(fā)揮保護(hù)作用有三方面：上調(diào)GRP78等伴侶蛋白的表達(dá)，促進(jìn)未折疊蛋白的折疊；下調(diào)伴侶蛋白外其余蛋白的合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷；促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的降解[25]。在哺乳動(dòng)物中，UPR以上過(guò)程主要依靠ATF6、IRE1以及PERK 這3條信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，三者也在一定水平上反映了ERS的強(qiáng)弱程度[4]。CHI等[23]的研究結(jié)果表明，MCAO大鼠 ATF6、XBP-1以及eIF-2α表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，而三者在ADSCs治療組的表達(dá)量極顯著低于MCAO組。本試驗(yàn)也對(duì)ERS的3條信號(hào)通路做了進(jìn)一步探究。結(jié)果顯示，在建立模型1 d后，各組的ATF6、IRE1以及PERK這3個(gè)信號(hào)通路起始分子的mRNA表達(dá)量均高于術(shù)前，這說(shuō)明3條信號(hào)通路均參與了在此模型所致的ERS的調(diào)節(jié)。而且ADSC-CM組和ADSCs組的三者表達(dá)水平顯著均低于模型組和DMEM對(duì)照組，這說(shuō)明ADSC-CM能顯著下調(diào)I/R損傷所致的ERS 3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)；說(shuō)明ADSC-CM可以通過(guò)抑制過(guò)度的ERS，減輕機(jī)體損傷。

如果ERS過(guò)于強(qiáng)烈或者持續(xù)存在時(shí)，UPR生存信號(hào)將會(huì)啟動(dòng)凋亡信號(hào)，會(huì)激活3條信號(hào)通路下游相關(guān)凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。越來(lái)越多的證據(jù)表明ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡是許多疾病發(fā)生的主要原因[21,26]。ERS誘導(dǎo)的下游凋亡途徑主要有Caspase-12激活通路、CHOP激活通路和JNK激活通路。值得注意的是Caspase-12只存在于鼠上，而在豬中目前尚未發(fā)現(xiàn)Caspase-12或者同功能的Caspase家族其他成員[27]。同時(shí)相關(guān)研究表明[28]，在缺血性肝ERS中，ATF4-CHOP通路是肝細(xì)胞主要的凋亡途徑。持續(xù)過(guò)度的ERS會(huì)誘導(dǎo)許多凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中以ATF4等為代表的眾多蛋白均能促使誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的CHOP過(guò)表達(dá)，而CHOP的表達(dá)會(huì)加劇細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)I/R損傷和細(xì)胞凋亡[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，該肝損傷模型能顯著上調(diào)ATF4和CHOP的mRNA表達(dá)水平，而ADSC-CM和ADSCs治療組的ATF4和CHOP的mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組和DMEM對(duì)照組，說(shuō)明ADSC-CM和ADSCs治療可以抑制ERS誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞，這與肝臟組織病理結(jié)果相一致。胡捷等[29]也證實(shí)了人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)液可以抑制衣霉素導(dǎo)致的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的ERS，并顯著降低CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)水平，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，在小型豬肝臟I/R合并肝臟部分切除損傷模型中，I/R和肝切除等損傷能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生過(guò)度的ERS，而ADSC-CM干預(yù)可減少過(guò)量的ERS并抑制ERS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝臟手術(shù)過(guò)程中的I/R和外科損傷。