馮振宇 孟霜 常劍敏 周曉榮 史敏 趙建平

中圖分類號R285.5

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0179-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.02.10

摘要 目的：探討偽士的寧對人結(jié)腸癌HT-29細胞凋亡的影響及其機制。方法：取人結(jié)腸癌HT-29細胞，隨機分為空白組和低、中、高劑量偽士的寧組（125、250、500 μmol/L），加入不合藥培養(yǎng)基或含相應濃度偽士的寧的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況和線粒體跨膜電位;采用Western blotting法檢測細胞中P53、Caspase-3、Caspase-9、兔源DNA修復酶（c-PARP）、Bcl-2的蛋白表達水平。結(jié)果：與空白組比較，低、中、高劑量偽士的寧組細胞凋亡率顯著升高，線粒體跨膜電位均顯著降低（P<0.01），且均呈現(xiàn)濃度依賴趨勢。中、高劑量偽士的寧組細胞中P53、Caspase-3、Caspase-9、c-PARP蛋白表達水平較空白組均顯著升高，低、中、高劑量偽士的寧組細胞中Bcl-2蛋白表達水平則顯著降低（P<0.05或P

關鍵詞 偽士的寧;結(jié)腸癌;HT-29細胞;凋亡;線粒體跨膜電位;機制;P53;Caspase-3;Caspase-9;兔源DNA修復酶;Bcl-2

結(jié)腸癌是一種常見的臨床惡性腫瘤，目前我國結(jié)腸癌發(fā)病率和病死率越來越高，在全部惡性腫瘤中位居第5位，且確診時大多數(shù)已發(fā)展至中晚期，嚴重威脅患者的身體健康和正常生活[1]。中醫(yī)藥輔助治療結(jié)腸癌有助于提高患者在治療過程中的免疫力，減少放化療帶來的不良反應，降低復發(fā)率，改善預后[2]。馬錢子具有抑菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗炎的功效[3]。近年來，馬錢子活性成分的抗腫瘤作用已成為研究的熱點，相關研究表明，馬錢子堿在肝癌、乳腺癌、血液系統(tǒng)腫瘤、基底樣鱗狀細胞癌、S180肉瘤等方面均表現(xiàn)出一定的抑制作用[4]。本課題組前期對馬錢子進行了系統(tǒng)的提取、分離、純化研究，獲得馬錢子堿、士的寧、偽士的寧等單體生物堿成分;進一步就上述單體生物堿類成分對結(jié)腸癌細胞的抑制作用進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)偽士的寧對HT-29細胞的抑制作用較強（擬另文發(fā)表）。偽士的寧分子式為C21H22N203，分子量為350（結(jié)構(gòu)式見圖1），其在人類結(jié)腸癌治療中的應用尚未見報道。因此，本研究考察了偽士的寧對HT-29細胞的線粒體跨膜電位、細胞凋亡、相關凋亡蛋白等的影響，并初步探討其抗結(jié)腸癌的可能作用機制，旨在為該單體化合物臨床用于結(jié)腸癌的治療提供實驗基礎。

l 材料

1.1 儀器

Cyto FLEX型流式細胞儀（美國Beckman公司）;MC0-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（臺灣Sanyo公司）;IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;DYC2-24DN型垂直電泳儀、DYC2-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）;5702R型低速離心機（德國Eppendorf公司）;微量移液器（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 藥品與試劑

偽士的寧對照品（本課題組自制：參照前期研究工藝，取馬錢子藥材，經(jīng)加熱回流提取，硅膠柱色譜、薄層色譜、半制備高效液相色譜等分離純化，即得;純度：95.0%）;0.25%胰蛋白酶（批號：15050065）、胎牛血清（FBS，批號：10099-141）、Mc Coys 5A培養(yǎng)基（簡稱“5A培養(yǎng)基”，批號：16600-082）均購自美國Gibco公司;青霉素一鏈霉素雙抗（批號：PB180120）、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：PB180327）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒（批號：KGA108）、線粒體膜電位檢測試劑盒（批號：KGA602）均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;蛋白Marker（加拿大Fermentas公司，批號：26619-1）;兔源DNA修復酶（PARP）多克隆抗體（美國Affinity公司，批號：AF7023）;兔源P53多克隆抗體（批號：10442-1-AP）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（批號：BM0627）、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗小鼠二抗（批號：BA1051）、HRP標記羊抗兔二抗（批號：BA1054）均購自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人Caspase-3單克隆抗體（批號：ab184787）、兔抗人Cas-pase-9單克隆抗體（批號：ab202068）、兔源Bcl-2多克隆抗體（批號：ab59348）均購自英國Abcam公司;ECL化學發(fā)光底物試液（美國Thermo Scientific Pierce公司，批號：NCI5079）;X光膠片（日本柯達公司，批號：XBT-1）;顯影定影試劑盒（天津市漢中攝影材料廠）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為去離子水。

1.3 細胞

人結(jié)腸癌HT-29細胞（批號：CL-0118）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將HT-29細胞置于含10% FBS+I%青霉素一鏈霉素雙抗混合溶液[4-5]的5A培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）中，在37℃、5% C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)試驗。

2.2 偽士的寧對HT-29細胞凋亡的影響考察

取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HT-29細胞，以2.5x10⁵個/孔接種于6孔板中，在37℃、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細胞分為空白組和偽士的寧低、中、高劑量組（125、250、500 μmol/L;劑量根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果制定），分別加入不含藥的5A培養(yǎng)基或含有相應濃度藥物的5A培養(yǎng)基后，在37℃、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。取出細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集細胞，以1 000 r/min離心5min;除去上清液，加入適量PBS重懸、潤洗2次后，以1 000 r/min離心5min;除去上清液，將細胞重懸于PBS 100 μL中，緩慢加入預冷的80%乙醇700 μL，再加入Binding Buffer 500 μL重懸細胞;加入AnnexinV-FITC試劑5μL混勻后再加入PI試劑5μL，輕輕振搖混勻，室溫避光反應15 min使染色;采用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡情況。

2.3 偽士的寧對HT-29細胞線粒體跨膜電位的影響考察

按“2.2”項下方法取HT-29細胞接種、培養(yǎng)、分組、加入相應藥物并培養(yǎng)48 h后，收集細胞，以1 000 r/min離心5 min，除去上清液，用PBS洗滌細胞3次;以0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，以1 000 r/min離心5 min;棄去上清液，加入適量PBS重懸、潤洗3次，收集不多于1X10⁶個/mL的細胞，以JC-1工作液（取10 xlncubation Buffer，以滅菌水稀釋成1xlncubation Buffer，預熱至37℃;吸取線粒體膜電位檢測試劑盒中的JC-1試劑1μL，加入1×Incubation Buffer 1 000 μL稀釋，即得）1 000 μL混懸，在37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min;室溫下以1 200r/min離心5 min，收集細胞，用1xlncubation Buffer潤洗2次，再以lOxlncubation Buffer 200 μL重懸細胞后，用流式細胞儀檢測分析其跨膜電位變化。

2.4 偽士的寧對細胞中Caspase-3、P53、Caspase-9、c-PARP、Bc1-2蛋白表達的影響考察

采用Westem blotting法測定細胞中各目標蛋白的表達水平。取“2.2”項下HT-29細胞接種、培養(yǎng)、分組、加入相應藥物并培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌3次;棄去PBS液，培養(yǎng)皿冰浴，每皿細胞加入含PMSF的裂解液進行裂解后，提取蛋白。取蛋白40 μg，在60V電壓下電泳，待Marker出現(xiàn)紅色條帶時，將電壓升至120V繼續(xù)電泳;然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液在室溫條件下?lián)u床封閉2h，加入β-actin（1：1 000）、P53（1：2 000）、Caspase-3（1：2 000）、PARP（1：1 000）、Caspase-9（1：2 000）、Bcl-2（1：800）等相應一抗，于4℃下孵育過夜;以TBST緩沖液洗滌6次，加入HPR標記二抗（1：50 000），于37℃下?lián)u床孵育2h：以TBST緩沖液洗滌6次，ECL顯色曝光，晾干膠片，掃描。以β-actin為參比，采用BandScan 5.O軟件分析目標蛋白條帶的相對灰度值，用以表示蛋白表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.O統(tǒng)計軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 偽士的寧對HT-29細胞凋亡的影響

流式細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，偽士的寧低、中、高劑量組細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著升高（P<0.01），且隨著偽士的寧濃度的升高，細胞總凋亡率也隨之升高，表明偽士的寧對HT-29細胞的促凋亡作用呈濃度依賴趨勢。各組細胞流式細胞凋亡圖見圖1（圖中，右下象限為早期凋亡細胞群，右上象限為晚期凋亡細胞群）;凋亡率測定結(jié)果見表1。

3.2 偽士的寧對HT-29細胞線粒體跨膜電位的影響

線粒體跨膜電位檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，偽士的寧低、中、高劑量組細胞的線粒體跨膜電位顯著降低（P<0.01），且隨著偽士的寧濃度的升高，細胞線粒體跨膜電位隨之降低，表明偽士的寧對HT-29細胞跨膜電位的降低作用呈濃度依賴趨勢。各組細胞流式細胞跨膜電位圖見圖3（圖中，紅色熒光表示線粒體跨膜電位較高，呈聚集狀態(tài);綠色熒光代表線粒體跨膜電位較低，呈離散狀態(tài)）;線粒體跨膜電位檢測結(jié)果見表2。

3.3 偽士的寧對HT-29細胞相關蛋白表達的影響

Western blotting法檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，偽士的寧中、高劑量組細胞中P53、Caspase-3、Caspase-9、c-PARP的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;偽士的寧低、中、高劑量組細胞中Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見圖4、表3。

4 討論

馬錢子為馬錢科植物馬錢的干燥成熟種子，具有通絡止痛、散結(jié)消腫的功效，常用于治療跌打損傷、骨折腫痛、風濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽瘡毒、咽喉腫痛等嘲。近年來，關于馬錢子活性成分抗腫瘤作用的研究取得了一定成果[7]。前期研究證實，偽士的寧作為馬錢子中提取獲得的生物堿單體化合物，對結(jié)腸癌具有一定的抑制作用，且毒副作用較小。因此，本研究通過考察偽士的寧作用于HT-29細胞后對其凋亡、線粒體跨膜電位及相關凋亡蛋白表達水平等的影響，對該化合物抗結(jié)腸癌的可能作用機制進行了初步的探討。

正常情況下，細胞線粒體外膜為高通透性，而內(nèi)膜通透性相對較低，線粒體內(nèi)膜上存在的質(zhì)子泵可將基質(zhì)中的質(zhì)子泵入膜外，從而使得線粒體膜內(nèi)外形成跨膜電位[8]。線粒體跨膜電位的降低是細胞凋亡早期的不可逆事件[7]。當線粒體膜內(nèi)外的電勢差減少時，線粒體膜電位降低，可引起線粒體膜內(nèi)外發(fā)生一系列生化改變。在各種促細胞凋亡信號作用下，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔不可逆地過度開放，導致線粒體跨膜電位崩解、呼吸鏈解耦聯(lián)、線粒體基質(zhì)滲透壓升高、內(nèi)膜腫脹，并釋放出膜間促凋亡蛋白，最終導致細胞凋亡[9]。因此，線粒體跨膜電位的改變預示細胞可能出現(xiàn)凋亡，可為細胞凋亡的機制研究提供一定的理論基礎。

本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，不同劑量偽士的寧作用于HT-29細胞48h后，能顯著升高細胞凋亡率（P<0.01），表明偽士的寧具有明顯的促HT-29細胞凋亡的作用，且這一作用呈濃度依賴趨勢;同時，不同劑量的偽士的寧均能顯著降低HT-29細胞的線粒體跨膜電位（P<0.01），并使電位由聚集態(tài)向離散態(tài)變化的趨勢增大，且這一作用呈濃度依賴趨勢。

Bcl-2家族由抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（Bax、Bak等）組成，共同構(gòu)成一個相互作用的控制細胞凋亡的網(wǎng)絡，是細胞凋亡內(nèi)源性線粒體途徑的重要調(diào)節(jié)因子[10]。Bcl-2是細胞凋亡的負調(diào)節(jié)因子。Cas-pase家族蛋白分為啟動子（包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9）和效應器（包括Caspase-3、Caspase-6、Cas-pase-7），啟動子的作用是在各種刺激下（如藥物、生長因子等）發(fā)生自我激活并識別和活化下游的Caspase蛋白，實施蛋白通過作用于特異性底物使細胞發(fā)生凋亡，Cas-pase活化可導致細胞凋亡進入不可逆階段[11]。Cas-pase-3是Bcl-2的下游調(diào)控蛋白;PARP是Caspase-3的切割底物，也是Caspase-3激活的標志。Caspase-3被激活后構(gòu)象發(fā)生改變形成剪切體cleaved-Caspase-3，cleaved-Caspase-3進一步剪切PARP，使總PARP減少、cleaved-PARP增加，導致PARP失去正常功能，最終使得核小體間DNA降解、細胞發(fā)生凋亡[10]。P53是Bcl-2的上游調(diào)控基因，P53通過調(diào)節(jié)Caspase-3蛋白酶上調(diào)Bcl-2的基因表達，從而影響相關凋亡功能[12]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量偽士的寧作用于HT-29細胞后，Cas-pase-3、Caspase-9、P53、c-PARP（PARP的活化形式）的蛋白表達水平均顯著升高，低、中、高劑量偽士的寧作用后使細胞中Bcl-2蛋白表達均顯著下調(diào)，表明其能夠通過調(diào)控P53、Caspase-3、PARP、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表達誘導HT-29細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，偽士的寧可能通過上調(diào)P53蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，改變線粒體膜電位，然后激活Cas-pase-3、c-PARP、Caspase-9的表達，進而激活內(nèi)源性線粒體通路，發(fā)揮促進結(jié)腸癌HT-29細胞凋亡的作用。但該化合物對結(jié)腸癌細胞的具體促凋亡途徑還有待于進一

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（收稿日期：2019-06-25修回日期：2019-12-03）

（編輯：段思怡）

△基金項目：國家國際科技合作專項項目（No.2014DFA33150）

*副主任醫(yī)師，碩士生導師，碩士。研究方向：經(jīng)方治療疑難病。電話：0351-2150899.

E-mail： sxfzy@163.com

#通信作者：主任藥師，博士生導師，碩士。研究方向：中藥藥理學。電話：0351-2150899.

E-mail： mengzhaoshuang@126.com