劉若妍，李文學(xué)，顧沛雯*，李嘉鴻

（1. 寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

葡萄霜霉病是一種世界性葡萄病害。葡萄感病后，可導(dǎo)致葉片早期脫落，果實品質(zhì)變劣，對樹勢以及產(chǎn)量造成極大影響[1-2]。國內(nèi)外研究表明，該病害的發(fā)生與田間溫濕度以及葉片濕潤時間密切相關(guān)。在國外，Thind等[3]認為霜霉孢子囊萌發(fā)的溫度范圍為3～30 ℃，最適溫度為25～30 ℃。Rumbolz等[4]認為濕度為95%～100%，伴有游離水的存在時是孢子囊形成的最適條件。Gobbin等[5]認為，在田間相對濕度為92%及以上、濕度持續(xù)時間超過7 h時葡萄霜霉病即發(fā)生。在國內(nèi)，沙月霞等[6]認為孢子囊萌發(fā)溫度為5～27 ℃；葡萄霜霉病接種后，在相對濕度76%的條件下即可發(fā)生，且濕度越高發(fā)病越重。靜大鵬等[7]認為葡萄霜霉菌的孢子囊只有在水中才能萌發(fā)，菌液與葉片接觸時間越長，葡萄霜霉病發(fā)生越早，程度越嚴重。趙勝榮等[8]認為田間相對濕度大于或等于80%時，隨著累計天數(shù)增加，發(fā)病率和病情指數(shù)均增長。

目前，國內(nèi)對葉片濕潤時間和田間相對濕度與霜霉病發(fā)生狀況的研究多數(shù)以鮮食葡萄為研究對象，而對釀酒葡萄卻鮮有報道。寧夏賀蘭山東麓地處世界葡萄種植“黃金地帶”[9]，釀酒葡萄種植面積達3.3萬 hm2[10]。近年來，隨著釀酒葡萄種植面積不斷擴大，病蟲危害逐年加重，尤其是葡萄霜霉病常年的病情指數(shù)可達30%～35%，流行年份的病情指數(shù)高達60%[11-12]；霜霉病的流行嚴重影響釀酒葡萄質(zhì)量與產(chǎn)量，成為葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要制約因子之一。針對此情況，本試驗以寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄為對象，采用離體葉片接種法，研究室內(nèi)不同保濕條件以及菌液和葉片接觸時間與釀酒葡萄霜霉病發(fā)生的關(guān)系；同時定點監(jiān)測田間相對濕度，結(jié)合田間發(fā)病情況調(diào)查，研究田間相對濕度對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生狀況的影響。為賀蘭山東麓釀酒葡萄霜霉病的有效監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試葉片

2018年8 月采集寧夏賀蘭山東麓蒲尚酒莊田間‘赤霞珠’和‘紫大夫’葡萄第3～5節(jié)位上生長的健葉。用清水沖洗，再用75%的酒精消毒，確保葉片上無蟲卵及害蟲等干擾因素后，再用無菌水沖洗5次，自然晾干后備用。

1.1.2 供試菌液

田間采集典型葡萄霜霉病菌葉片，用清水沖洗多次，直至將灰塵洗凈。接著用小毛筆刷下病葉葉背霉層配置成菌懸液，用移液槍吸取200 μL菌懸液均勻滴加到健康葉背上，然后將健康葉片放在保濕培養(yǎng)箱中24 ℃條件下保濕培養(yǎng)，待健康葉片生長出新的霉層，再用小毛筆刷下配置成菌懸液。用計數(shù)板測定其濃度，確保濃度范圍在1×106～2×106個/L，備用。

1.1.3 田間相對濕度數(shù)據(jù)監(jiān)測

使用佳多農(nóng)林小氣候信息采集系統(tǒng)。利用L92-1溫濕度監(jiān)測器等設(shè)備對田間溫度（-40～60 ℃，分辨率0.1 ℃）、相對濕度（Relative humidity，RH）（0～100%，分辨率0.1% RH）等數(shù)據(jù)的采集。

1.2 方法

1.2.1 葡萄霜霉病侵染過程及病原的觀察

選擇大小基本一致的‘赤霞珠’葡萄第3～5節(jié)的健康葉片若干，將葉片葉背朝上放入鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，然后在葉背標記5個孢子懸浮液點，用移液槍吸取200 μL制備好的孢子囊懸液滴到健康葉片上，接種3 h后用脫脂棉吸凈。將接種好的葉片放到24 ℃、75%RH的保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用體視顯微鏡觀察并記錄同一葉片在不同保濕時間下霜霉病的侵染情況，2 h一次，直到癥狀內(nèi)眼可見，選擇侵染變化明顯的情況進行分析。用小毛筆刷下其他葉片在不同保濕時間下新生的霉層，配制成懸浮液，將懸浮液滴在載玻片上，然后正置于熒光相差顯微鏡下觀察病原的形態(tài)。

1.2.2 菌液接種時間與保濕條件對霜霉病發(fā)生的影響

采用離體葉片接種法，選擇大小基本一致的‘赤霞珠’和‘紫大夫’葡萄第3～5節(jié)的健康葉片。將樣品葉片的葉背朝上放入鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，葉柄用濕潤的脫脂棉包住，然后在葉背標記5個孢子懸浮液點，再用移液槍吸取200 μL菌懸液分別滴加至每個點，同時以等量清水接種為對照。待菌液分別在葡萄葉片上分別保持1 h、3 h、5 h、7 h后用脫脂棉吸凈接種液。將接種完成的葉片放在室內(nèi)24 ℃、12 h光暗交替，且相對濕度為75%、85%和95%的保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每次處理10片葉，重復(fù)3次。觀察霜霉病發(fā)病始期1 h、3 h、5 h、7 h、9h、12 h、16、20 h、24 h、48 h后的發(fā)病情況并計算病情 h指數(shù)。

1.2.3 田間相對濕度對葡萄霜霉病發(fā)生情況的影響

在7月15日至9月25日期間，監(jiān)測田間葉幕間溫濕度數(shù)據(jù)，每日間隔1 h記錄1次葉片周圍溫濕度，每日記錄24個數(shù)值。統(tǒng)計每天田間相對濕度75%及以上持續(xù)時間，同時結(jié)合每3～5 d的霜霉病發(fā)生情況調(diào)查。

1.2.4 發(fā)病情況調(diào)查

室內(nèi)和田間的病情調(diào)查均采用9級記載法[13]，根據(jù)病斑

面積占葉面積的百分率劃分嚴重度分級指標：

0級：葉片無病斑；

1級：葉片病斑面積占整個葉面積的5%以下；

3級：葉片病斑面積占整個葉面積的6%～25%；

5級：葉片病斑面積占整個葉面積的26%～50%；

7級：葉片病斑面積占整個葉面積的51%～75%；

9級：葉片病斑面積占整個葉面積的75%以上。

病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×該級代表值)/(調(diào)查病葉盤數(shù)×最高級代表值)]×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄霜霉菌侵染過程及病原觀察

由圖1可知，在24 ℃、75%RH的情況下，釀酒葡萄霜霉孢子囊在葉片表面局部的侵染過程。保濕2 h時，葉柄處長出霜霉孢子囊（圖1B）；保濕6 h后生出菌絲（圖1C）；保濕12 h時，孢子囊產(chǎn)生新的游離孢子，進行大面積侵染（圖1D）；保濕20 h時，孢子囊侵染葉片，霜霉病癥狀肉眼可見（圖1E）。

如圖2所示，在24 ℃、75%RH的情況下，不同保濕時間下的病原形態(tài)。保濕2 h時，有少量孢囊梗和孢子囊存在，霜霉菌的孢囊梗可形成直角分枝，孢子囊無色透明，呈卵圓或橢圓狀，無菌絲（圖2A）；保濕12 h時，孢囊梗和孢子囊數(shù)量增多，且有透明細管狀菌絲生成，菌絲與孢囊?？v橫交錯（圖2B）。

2.2 室內(nèi)接種時間與保濕條件對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生的影響

2.2.1 室內(nèi)接種時間對‘赤霞珠’霜霉病發(fā)生的影響

由圖3、表1可知，在75%RH的條件下，菌懸液與葉片接觸1 h后，最早出現(xiàn)癥狀時間是保濕5 h；保濕24 h時，葉片可見針狀或點狀病斑（圖3A）。菌懸液與葉片接觸3 h后，最早保濕3 h出現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為1.22；保濕7 h后病情指數(shù)有明顯差異；保濕24 h時，葉片可見點狀白色霜霉層（圖3B）。菌懸液與葉片接觸5 h后，保濕3 h葉片即出現(xiàn)癥狀；保濕5 h、7 h和9 h對霜霉病的影響程度差異明顯；保濕24 h時，葉片可見片狀白色霜霉層，發(fā)病情況較菌液留存為3 h的葉片更重（圖3C）。在菌懸液與葉片接觸7 h后，保濕9 h時病情指數(shù)達到最高，為20.25；同時霜霉病癥狀最為嚴重，保濕24 h時，葉片上霜霉菌絲生長較為密集，連接成白色霉層，面積較大（圖3D）。綜上所述，在75%RH的條件下，葡萄霜霉病菌懸液與葉片接觸1 h即可導(dǎo)致‘赤霞珠’發(fā)病，接種后保濕3 h為最早發(fā)病時間，需要菌液在葉片上至少留存3 h；接種時間越長，霜霉病出現(xiàn)癥狀越早、程度越重；同時隨著保濕時間增長，接種時間長的葉片發(fā)病癥狀更顯著。

2.2.2 不同濕度處理下‘赤霞珠’霜霉病的發(fā)病情況

由表2可知，在75%RH、85%RH的條件下，兩者保濕5 h前發(fā)病情況差異均不明顯，但在不同的保濕時間下，85%RH的病情指數(shù)均高于75%RH；在95%RH的條件下，保濕1 h后發(fā)生狀況即有明顯變化，且病情指數(shù)均高于75%RH、85%RH，保濕20 h時，病情指數(shù)達到最高，為42.78；表明在葡萄霜霉病菌懸液與葉片接觸3 h后，隨著濕度的增高，霜霉病發(fā)生的越早，且發(fā)病程度越嚴重。保濕3 h時，75%RH的葉片霜霉病病情指數(shù)為1.22，95%RH的病情指數(shù)達到8.33，兩者相差7.11；而保濕20 h時，75%RH的病情指數(shù)是25.56，95%RH的病情指數(shù)是42.78，兩者相差17.22；說明隨著保濕時間的延長，不同濕度之間的差異也越明顯，霜霉病在高濕條件下蔓延的速度更快。

表1 菌懸液與葉片接觸時間對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生的影響Table 1 Effect of contact time between bacterial suspension and leaves on downymildew of vitis vinifera (RH=75%)

表2 菌懸液與葉片接觸3 h后不同濕度處理下釀酒葡萄霜霉病的發(fā)病情況Table 2 The incidence of downy mildew of vitis vinifera under different humidity treatments after contact with the leaves for 3 h

2.3 釀酒葡萄品種在室內(nèi)條件下霜霉病的發(fā)生情況

由表3可知，不同菌液存留時間和相對濕度對不同品種的影響不同。在75%RH的條件下，菌液存留1 h后，‘紫大夫’的病情指數(shù)為30.89，大于‘赤霞珠’的病情指數(shù)25.56；在菌液存留3 h后，‘赤霞珠’病情指數(shù)為41.73，超過了‘紫大夫’的病情指數(shù)34.44；表明隨著菌液存留時間的增高，‘赤霞珠’侵染速度更快，發(fā)病程度更重。在菌液存留1 h的情況下，75%RH和85%RH時，‘赤霞珠’的病情指數(shù)均小于‘紫大夫’；但在95%RH時，‘赤霞珠’病情指數(shù)高于‘紫大夫’；表明‘紫大夫’發(fā)病對濕度以及接種時間的要求相對低于‘赤霞珠’，更易發(fā)??；同時表明隨著濕度增高，‘赤霞珠’發(fā)病速度越快，程度越重。

表3 不同條件下‘紫大夫’和‘赤霞珠’的發(fā)病情況（保濕48 h）Table 3 The incidence of 'Dunkelfelder' and 'Cabernet Sauvignon' under different conditions (moisturizing 48 h)

2.4 田間相對濕度對赤霞珠霜霉病發(fā)生的影響

由圖4可知，在7月20日至24日夜間，葉片平均濕潤時間最高達到6 h后霜霉病癥狀發(fā)生，白天則需要達到8 h后才能發(fā)生；由于自然濕度條件受環(huán)境影響比較大，同時溫度和風(fēng)速會加快干燥的速度，所以延長發(fā)生的時間；白天溫度較高，干燥的速度比夜晚更快，所以白天需要的時間更長。從8月17日開始，田間濕潤時間增多，且夜晚的累計濕潤的時間比白天長，同時病情指數(shù)增高；在8月18日病情指數(shù)為17.93，在10月3日達到57.37；表明夜間濕潤對霜霉病的發(fā)生和蔓延影響比白天更大，說明霜霉病主要在夜晚傳播；隨著田間相對濕度持續(xù)的時間越長，病害發(fā)生程度逐漸加重，這與室內(nèi)試驗結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

目前，國外對霜霉病發(fā)生狀況的研究報道較多。在位于美國西部沿海，典型的地中海氣候的加利福尼亞州，病原體通過雨水和風(fēng)吹散傳播，感染過程需要1.5 h左右，通常發(fā)生在早晨[14]。Koopman等[15]認為，在室外霜霉孢子囊的形成相對濕度必須在95%～100%，同時最佳的溫度條件是20～25 ℃。Altizer等[16]認為孢子體在一天內(nèi)形成，其必要條件是在黑暗環(huán)境下保持4 h。

沙月霞等[6]學(xué)者對賀蘭山東麓地區(qū)釀酒葡萄霜霉病的發(fā)病情況進行研究，明確在賀蘭山東麓地區(qū)，當(dāng)室外濕度高于76%時，霜霉病即可發(fā)病。本試驗研究結(jié)果表明，在室內(nèi)濕度為75%的條件下，葡萄霜霉菌接種后保濕3 h為最早發(fā)病的時間；室外環(huán)境濕度條件受到的干擾因素較多，所以保濕6 h為葡萄霜霉病最早發(fā)病時間，但不排除保濕3 h時有潛在發(fā)病隱患；接種時間越長，霜霉病發(fā)病越早、越重；濕度的增高，縮短了侵染的時間，使霜霉病的病情指數(shù)增高，發(fā)病情況也愈加嚴重。

盡管寧夏賀蘭山東麓蒸發(fā)量大，有時降雨后并不能維持葉片的濕潤[17]，但夏季7—9月平均濕度達到了69%[18]，出現(xiàn)降雨時相對濕度大于80%，遠高于本試驗霜霉發(fā)病的最低濕度。因此，降雨之后，應(yīng)盡快排水、通風(fēng)，保證葉片表面干燥，抑制霜霉菌侵染。同時，葉幕間疏密程度對霜霉病的發(fā)生也有一定的影響；越密集的葉片越易在降雨、灌溉后造成葉片間高濕的微氣候環(huán)境，最終導(dǎo)致霜霉病的發(fā)生[19-20]。因此，當(dāng)?shù)乜筛鶕?jù)病害發(fā)生情況，進行適當(dāng)?shù)娜~幕間管理，比如摘葉、打葉、修剪葉片薄厚程度等。

此外，不同釀酒葡萄品種對霜霉病的抗性不同[21]，‘霞多麗’‘美樂’‘品麗珠’等[22-23]品種均易發(fā)生霜霉病。本試驗通過‘赤霞珠’和‘紫大夫’兩個品種進行對比，為進一步探究不同釀酒葡萄品種對霜霉病抗性差異奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明‘紫大夫’在低濕條件下更易發(fā)病；隨著濕度條件增高，‘赤霞珠’蔓延速度更快，程度更重。當(dāng)?shù)胤N植釀酒葡萄時，盡量不要選擇易感病品種或?qū)⒁赘胁∨c抗病品種嫁接種植。

通過在室內(nèi)和室外定時測定葉幕間的微氣候條件，得出葡萄霜霉病在室外濕度為75%的條件下，保濕6 h為霜霉病最早發(fā)病時間，但不排除保濕3 h時有潛在發(fā)病隱患，因此濕度為75%、保濕3 h應(yīng)為霜霉病發(fā)病的預(yù)警；當(dāng)達到這個條件時，應(yīng)提前噴施藥劑來抑制孢子囊的形成、萌發(fā)和侵染。