呂 航，張全麗，孫向明，3*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076；2.北京博達(dá)綠洲醫(yī)藥科技研究有限公司，北京 101113；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

山藥為薯蕷科(Dioscoreaceae)植物薯蕷(Dioscoreaoppositathunb)的干燥根莖，是中醫(yī)常用的一味健脾補(bǔ)氣的良藥.2015年版《中華人民共和國藥典》一部記載山藥具有“補(bǔ)脾養(yǎng)胃，生津益肺，補(bǔ)腎澀精”的功能[1-3]，可用于治療“脾虛食少，久瀉不止，肺虛喘咳，腎虛遺精，帶下，尿頻，虛熱消渴”等癥.藥用山藥分布較廣[4]，除少數(shù)熱帶地區(qū)外，幾乎各地均有栽培[5].山藥中含有多糖、尿囊素、皂苷、淀粉等多種有效成分[6-7]，其中尿囊素作為一種尿酸衍生物，具有修復(fù)上皮組織[8]、促進(jìn)傷口愈合，麻醉鎮(zhèn)痛等作用[9-10].雖然截止目前，2015年版《中華人民共和國藥典》 尚未收錄山藥相關(guān)有效成分的含量測定項(xiàng)，但尿囊素已廣泛被研究人員用以評(píng)價(jià)山藥藥材質(zhì)量[11-14].鑒于以上空白，本實(shí)驗(yàn)收集了不同產(chǎn)地出產(chǎn)的山藥藥材，建立高效液相色譜法，旨在為山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供有益借鑒.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀 (Agilent1100)，檢測器：1100 series，色譜柱：Thermo C18(5 μm 4.6×250 mm)；UC-101-HTD超聲波清洗器 (北京凱維豐科技有限責(zé)任公司)； AL104電子天平 (梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；粉碎機(jī)(型號(hào)：LG-50 浙江省百瑞安百信藥機(jī)器械廠)；

1.2 試藥

液相分析用甲醇、乙腈為色譜純 (天津益仁達(dá)化學(xué)試劑廠)，實(shí)驗(yàn)用純化水(高碑店娃哈哈宏振飲用水有限公司).對(duì)照品尿囊素 (批號(hào)111501-200202).

1.3 藥材

山藥藥材采收于全國各地產(chǎn)區(qū)，藥材信息見表1.

表1 藥材信息

2 測定指標(biāo)及方法選擇

依照高效液相色譜法《中華人民共和國藥典》(2015版 四部 0512).

2.1 樣品溶液的制備

取尿囊素對(duì)照品放至室溫，精密稱取10 mg，置于10 mL容量瓶中，加水使其充分溶解后，定容至刻度，混合均勻，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液.再取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液于25 mL的容量瓶，用水定容至刻度，混合均勻，制成40 μg/mL對(duì)照品溶液，置于4 ℃避光保存.

取山藥粉末(過3號(hào)篩)，精密稱取0.5 g，置入100 mL三角錐形瓶中，精密加入50 mL 水，稱重，超聲處理30 min，冷卻，稱重，補(bǔ)重，取上清作為供試品溶液，過0.45 μm的濾膜，備用.

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo C18(5 μm 4.6×250 mm)；測定波長：224 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相為乙腈-水(2∶98).

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察

分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和空白溶劑5 μL注入高效液相色譜儀測定，繪制液相色譜圖，由色譜圖提示，在對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，流動(dòng)相在此峰位無吸收，對(duì)本品中含尿囊素量的測定無干擾，方法專屬性良好.

2.3.2 線性關(guān)系考察

取尿囊素對(duì)照品9.68 mg置10 mL容量瓶中，加水溶解，定溶至刻線，作為對(duì)照品母液，再分別取1 mL對(duì)照母液置5、10、25、50、100 mL的容量瓶中，分別加水定溶至刻線，混合均勻，過0.22 μm濾膜于自動(dòng)進(jìn)樣瓶內(nèi)，進(jìn)樣量分別為5 μL，觀察尿囊素的峰面積和保留時(shí)間，并以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y= 3 838.1x，線性系數(shù)r=0.999 8，結(jié)果表明：尿囊素10～1 000 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.見表2.圖1、2.

圖1 山藥含尿囊素量測定專屬性圖(從下到上圖譜分別為空白溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品、山藥)

編號(hào)質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)進(jìn)樣體積/μL進(jìn)樣量/μg峰面積標(biāo)曲19.6850.048 450 656標(biāo)曲219.3650.096 879 225標(biāo)曲338.7250.193 6156 011標(biāo)曲496.8050.484 0388 802標(biāo)曲5193.6050.968 077 9946標(biāo)曲6968.0054.840 03 706 630

圖2 尿囊素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為38.72 μg/mL的對(duì)照品溶液和供試品溶液在上述色譜條件下各重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量5 μL，測定峰面積.見表3、4.

表3 對(duì)照品試驗(yàn)精密度測定結(jié)果

表4 供試品試驗(yàn)精密度測定結(jié)果

尿囊素的對(duì)照品峰面積RSD為0.72%，供試品的峰面積RSD為0.77%,說明該儀器精密度良好.

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法，制備供試品溶液各6份，各精密吸取5 μL，分別進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，并計(jì)算含尿囊素量.見表5.

表5 重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果

以峰面積和供試品質(zhì)量濃度計(jì)算所含尿囊素量，并計(jì)算含尿囊素量的RSD值,RSD為1.30%.說明樣品重現(xiàn)性達(dá)標(biāo).

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，各精密吸取5 μL，按0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)間間隔，分別進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積.見表6.

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

供試液制備12 h內(nèi)測定，峰面積RSD為1.15%，色譜峰面積無明顯變化，在此時(shí)間內(nèi)，供試品溶液中待測組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定.

備注:因制備供試品的溶劑為水,樣品經(jīng)12 h后變渾濁,故需要低溫保存,不適合常溫12 h以上穩(wěn)定性.

2.3.6 樣品測定

取不同來源山藥藥材粉末，按“2.1項(xiàng)樣品溶液”制備樣品，按“2.2項(xiàng)色譜條件”進(jìn)樣.經(jīng)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地山藥藥材的含尿囊素量存在差異，湖北黃岡的佛手山藥所含尿囊素量最高，其次為四川的攀枝花山藥以及陜西的華山山藥.見表7.

表7 樣品測定結(jié)果

3 討 論

HPLC法因具有操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在近年來的報(bào)道中為測定山藥含尿囊素量最常用的分析方法[15].在流動(dòng)相的選擇時(shí)，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水(1∶99)、甲醇-水(4∶1)，乙腈-水(2∶98)等條件，因尿囊素本身極性較大，出峰時(shí)間較短，發(fā)現(xiàn)在甲醇-水(1∶99)的條件下檢測洗脫過快，不利于尿囊素的檢測.最后選用乙腈-水(2∶98)的條件進(jìn)行洗脫.經(jīng)查閱有以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫的文獻(xiàn)記錄，但鑒于其極性因素，本實(shí)驗(yàn)最終確定流速為0.4 mL/min，這樣可以將尿囊素的保留時(shí)間大大延長，出峰時(shí)間控制在8 min左右.

目前，國內(nèi)中藥市場尚存在無序競爭的混亂局面,由于來源不一、產(chǎn)地不同,摻雜使假,導(dǎo)致藥材質(zhì)量良莠不齊.很多中醫(yī)藥行業(yè)的亂象和問題，都與行業(yè)未能形成標(biāo)準(zhǔn)化有關(guān).以中藥材為例，作為中藥行業(yè)的核心環(huán)節(jié)，由于缺乏統(tǒng)一劃分標(biāo)準(zhǔn)等因素，中藥材一直是不合格產(chǎn)品的重災(zāi)區(qū).針對(duì)目前中醫(yī)藥行業(yè)所面臨的信任危機(jī)，可以說只要掌握了標(biāo)準(zhǔn)，就掌握了市場的主動(dòng)權(quán).尿囊素作為山藥中含量較高的有效成分，盡快建立及完善其含量測定方法，將有助于山藥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升.