王德鋼，賀鵬鵬，馬光皇，肖海兵，3，熊仁次，2，3*，韓 旭，3， 楊明祿，2，3*

(1.塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】香梨優(yōu)斑螟(Euzopherapyriella)屬鱗翅目螟蛾科，在新疆廣泛分布，可為害香梨、蘋果、棗、楊樹等果樹與林木，蛀食香梨與蘋果的果肉、果心、果皮和種子，在香梨、棗和楊樹上會蛀食韌皮部，導致腐爛病發(fā)生，使樹勢衰弱，嚴重時會造成枝干死亡，對新疆梨、棗、蘋果等產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展影響較大。香梨優(yōu)斑螟在南疆每年發(fā)生3～4代，后期有世代重疊現(xiàn)象，該蟲以老熟幼蟲越冬，10月份幼蟲逐漸進入越冬狀態(tài)，越冬代幼蟲翌年3月下旬開始化蛹，4月上中旬進行化蛹盛期，羽化盛期在4月下旬，第1、2代成蟲羽化高峰分別在6月上中旬和7月中下旬[1-3]。關(guān)于香梨優(yōu)斑螟分子生物學方面的研究較少，僅限于利用COI基因和ND5基因分析香梨優(yōu)斑螟遺傳結(jié)構(gòu)、分子鑒定[4-6]及不同蟲態(tài)內(nèi)參基因篩選[7]等研究。香梨優(yōu)斑螟作為幼蟲越冬的害蟲，研究幼蟲熱激蛋白(Heat shock protein，HSP)基因表達對低溫響應特征有助于了解其低溫滯育機理?！厩叭搜芯窟M展】熱激蛋白是一種保守的抗逆蛋白[8]，在昆蟲體內(nèi)普遍存在，作為分子伴侶參與一些重要的細胞生理活動，協(xié)助細胞內(nèi)其他蛋白折疊，避免蛋白聚集或錯誤折疊而降解，已發(fā)現(xiàn)的HSPs、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90等多種類型[9]。HSPs對外界環(huán)境變化響應迅速，逆境脅迫下高表達的HSPs可能對細胞起到保護作用[10]，促進維持細胞正常生理功能，提高機體響應的適應能力，從而增強抗逆性。1962年在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中首次發(fā)現(xiàn)一個基因與高溫誘導其唾腺的多線染色體產(chǎn)生膨突有關(guān)[11]，后證實果蠅染色體出現(xiàn)的膨突由高溫激發(fā)基因轉(zhuǎn)錄合成一種特殊的蛋白引起[12]，直到1982年在美國召開HSPs國際會議后HSPs才開始廣泛研究。HSPs對環(huán)境變化反應迅速，高溫和低溫的脅迫下都會誘導昆蟲表達不同的HSPs，助其度過不良的環(huán)境[13]，低溫和高溫處理沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)1 h及恢復室溫30 min后均能誘導HSP20.6基因表達上調(diào)[14]，-5 和0 ℃低溫處理的藥材甲(Stegobiumpaniceum)成蟲體內(nèi)HSP60的表達量均顯著高于對照組[15]，HSP70在高低溫脅迫下西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)能夠被誘導并且顯著表達[16]，沙棘木蠹蛾(Eogystiahippophaecolus)在低溫脅迫后HSP70基因表達上調(diào)，冷休克恢復處理后的1 h內(nèi)，HSP70的表達顯著增加，然后減少，冷休克促進了HSP70的表達[17]，沙棘木蠹蛾在不同的低溫處理下，Hsp90基因的表達也會上調(diào)，呈先升后下降的趨勢[18]?！颈狙芯壳腥朦c】HSPs家族基因?qū)囟茸兓T導高水平表達很多在昆蟲中都被證實，從對6和12月香梨優(yōu)斑螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的研究發(fā)現(xiàn)HSP70和HSP90基因的表達差異較大?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文篩選香梨優(yōu)斑螟幼蟲低溫脅迫下的內(nèi)參基因，進而選擇對溫度較敏感的HSP70和HSP90基因為目標，研究HSP70和HSP90基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 蟲源

香梨優(yōu)斑螟5齡幼蟲，6月中旬采集自阿拉爾市塔里木大學校內(nèi)梨園。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzon Reagent(康為世紀生物科技有限公司)；SGExcel UltraSYBR Master(上海生工生物有限公司)；PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)。超微量分光光度計(NanoDrop 2000，賽默飛世爾科技公司)；熒光定量PCR儀(Eprealplex4 S，Eppendorf)。

1.3 試驗方法

1.3.1 處理方法 香梨優(yōu)斑螟幼蟲分別于4 ℃低溫脅迫下處理0(CK)、0.25、1、3、8、12、18、24 h，每處理3頭幼蟲，重復3次，實時熒光PCR 4 個技術(shù)重復。處理后幼蟲立即放入液氮中冷凍，后置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 總RNA提取與cDNA合成 將樣品勻漿后，按照TRIzon Reagent說明書提取總RNA，超微量分光光度計檢測RNA樣品質(zhì)量和濃度。按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Erase說明去除總RNA中基因組DNA，并以1.0 μg總RNA為模板合成cDNA，稀釋10倍于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 內(nèi)參及HSP基因引物設計 從實驗室香梨優(yōu)斑螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得目標基因序列，分別是β-肌動蛋白基因(β-Actin，Actin)、β-微管蛋白基因(TUBulinbeta,TUB)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phos-phat dehydrogenase,GAPDH)、18s核糖體RNA(18s ribosomal RNA, 18s)、多聚泛素基因(ubiquitin,UBQ)，熱激蛋白基因HSP70和HSP90，利用Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量PCR引物(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.4 實時熒光PCR及擴增效率 擴增體系(20 μl)：熒光mix 12.5 μl，上下游引物各0.4 μl (終濃度0.2 μM)，cDNA模板1 μl，加ddH2O至20 μl。

擴增條件：95℃ 3 min(預變性)，95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s， 40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

通過設置10倍梯度稀釋，即cDNA 依次稀釋10、102、103、104、105倍作為模板進行擴增，繪制標準曲線，計算引物的擴增效率[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用ΔCt法[20]、GeNorm[21]、NormFinder[22]、BestKeeper[23]和RefFinder[24]軟件分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性。利用所篩選的穩(wěn)定內(nèi)參計算熱激蛋白基因相對表達量，公式為相對表達量=2-(ΔΔCt)[25]，利用DPS的Duncan法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及引物擴增效率分析

香梨優(yōu)斑螟幼蟲總RNA的OD260/280比值在1.9～2.1，利用試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。所設計引物的擴增產(chǎn)物溶解曲線為單一峰，均具有較好的特異性，擴增線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9817～0.9958，擴增效率也在93.08 %～100.97 %(表2)，設計引物符合相對定量檢測需要。

表2 引物擴增效率

2.2 候選內(nèi)參基因Ct值變化

候選的香梨優(yōu)斑螟5個內(nèi)參基因低溫脅迫下Ct值較為穩(wěn)定，變化趨勢較為一致。18s內(nèi)參基因表達豐度最高，Ct值5.38～9.58，GAPDH，TUB和UBQ基因表達豐度相對較低，Ct值15.16～24.58, 在低溫處理24 h時內(nèi)參基因表達都有一定的下降趨勢(圖1)。

圖1 內(nèi)參基因Ct值變化趨勢Fig.1 Variation trend of Ct value of reference genes

2.3 低溫脅迫候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

△Ct法計算結(jié)果UBQ分值最小，其次為GAPDH，TUB基因的分值最高、穩(wěn)定性最差(圖2-A)。NormFinder軟件分析的穩(wěn)定性為UBQ>GAPDH>Actin>18s>TUB(圖2-B)。GeNorm以參數(shù)M=1.5為閾值來判斷基因的穩(wěn)定性，小于1.5時表明該基因穩(wěn)定性良好，并且根據(jù)M值的大小來判斷基因穩(wěn)定性高低，M值越大則基因穩(wěn)定性越差，M值越小則基因的穩(wěn)定性越好[22]，所選內(nèi)參基因M值大小為0.563～1.446，說明候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性都較好，依次為Actin=GAPDH>UBQ>18s>TUB(圖2-C)。BestKeeper分析的為18s>UBQ>Actin>GAPDH>TUB，最穩(wěn)定的基因為18s，這與其他軟件的結(jié)果有所不同(表3)。經(jīng)RefFinder軟件綜合分析發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性依次為UBQ>GAPDH>Actin>18s>TUB(圖2-D)，UBQ和GAPDH基因綜合穩(wěn)定性最好，Actin穩(wěn)定性相對UBQ和GAPDH稍差，仍是較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，TUB穩(wěn)定性最差，對18s基因的穩(wěn)定性評價上存在一定分歧。

表3 BestKeeper 軟件分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性

a.△Ct法評價結(jié)果，B.Normfinder軟件評價結(jié)果，C.Genorm軟件評價結(jié)果，D.RefFinder軟件評價結(jié)果A：Evaluation results of △Ct，B：Evaluation results of Normfinder，C：Evaluation results of Genorm，D：Evaluation results of RefFinder

2.4 低溫處理下HSP70和HSP90基因表達特征

HSP70基因經(jīng)過低溫脅迫處理后，其相對表達

量分別是對照組的5.08、8.79、2.52、4.09、1.50、6.50、3.76倍，并于1 h處理時達到峰值，HSP70基因相對表達量明顯高于對照，初期及24 h末期顯著高于對照(圖3)。HSP90基因分別是對照組的4.01、12.80、7.00、2.60、1.70、4.48、4.48倍，于1 h處理時達到峰值，表達特征也與HSP70基因相似，在18 h后相對表達量趨于穩(wěn)定(圖4)。

圖3 HSP70基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of HSP70 gene

圖4 HSP90基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of HSP90 gene

3 討 論

實時熒光定量PCR是生物基因表達研究最廣泛的手段之一，而基因相對表達研究中內(nèi)參基因的選擇對結(jié)果影響很大[26]。曾在很長時間內(nèi)認為維持細胞正常生命代謝所必需的管家基因非常穩(wěn)定[27]，但隨著研究深入發(fā)現(xiàn)管家基因表達并非完全恒定的[28]，在不同處理條件下各管家基因的表達穩(wěn)定性存在一定差異，因此選擇適合的內(nèi)參基因顯得十分重要[29]。研究香梨優(yōu)斑螟在受低溫脅迫下熱激蛋白家族中HSP70和HSP90基因表達特征，首先需要篩選穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參，借助軟件評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，但不同軟件的評價結(jié)果存在一定差異，這種差異的出現(xiàn)是不同軟件的算法引起的[30]，在內(nèi)參基因篩選的研究中普遍存在，最終的穩(wěn)定性排名需要綜合分析[31-32]，昆蟲內(nèi)參篩選研究中Actin常被認為是理想的內(nèi)參，即使作為溫度脅迫時也較為穩(wěn)定[33-34]，在本研究中發(fā)現(xiàn)香梨優(yōu)斑螟老熟幼蟲在低溫脅迫處理后Actin基因也比較穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性比UBQ和GAPDH基因要差些，這點與水稻害蟲褐飛虱(Nilaparvatalugens)和白背飛虱(Sogatellafurcifera)的研究結(jié)果相同[35]。GAPDH基因穩(wěn)定性相對較好，在斜紋夜蛾(Ctenopseustisobliquana)溫度脅迫時被認為GAPDH是最佳內(nèi)參[28]，而在對瓜實蠅(Bactroceracucurbitae)的溫度脅迫研究中GAPDH基因穩(wěn)定性并不好[36]，昆蟲種類甚至蟲態(tài)不同內(nèi)參穩(wěn)定性都會存在差異，如二化螟(Chilosuppressalis)和褐飛虱(Nilaparvatalugens) 溫度脅迫的研究中以TUB基因作為內(nèi)參[37-38]，而本研究中發(fā)現(xiàn)TUB是5個候選內(nèi)參基因中最不穩(wěn)定的。

HSPs基因?qū)ν饨绛h(huán)境的迅速響應可能與細胞保護作用有關(guān)[10]，香梨優(yōu)斑螟幼蟲低溫脅迫下HSP70和HSP90在30 min顯著高表達，約1 h后達到峰值，推測HSPs受到外界低溫刺激后被大量誘導表達，以避免受到低溫傷害；在之后的處理時間內(nèi)表達量有所下降，應該是受到相應HSPs積累量調(diào)控所致，這種調(diào)控還表現(xiàn)在18 h時基因表達有所回升的現(xiàn)象，這與三葉草斑潛蠅(Liriomyzatrifolii)和B型煙粉虱(BemisiatabaciB-biotype)研究結(jié)論相似[39-40]。

4 結(jié) 論

5種內(nèi)參基因在香梨優(yōu)斑螟幼蟲低溫脅迫處理后表達有一定差異，除了TUB基因外，表現(xiàn)比較穩(wěn)定，其中UBQ基因穩(wěn)定性最好。在低溫脅迫下，HSP70和HSP90基因相對表達量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在18 h后有小幅度上升，并維持在較高的水平，這可能有助于提升幼蟲對低溫的耐受力。