李巧玲，韓 鳳, 2，肖 忠，任明波，胡開治, 2

(1. 重慶市藥物種植研究所，重慶 南川 408435；2. 重慶市道地藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，重慶 南川 408435)

【研究意義】根際是作物與土壤生態(tài)系統(tǒng)之間的交互界面，是作物發(fā)生物質(zhì)代謝與能量轉(zhuǎn)化最活躍的部位之一[1]，大量微生物定殖于此并與植物根系及周邊土壤發(fā)生密切的相互作用，對植物養(yǎng)分獲取、生長發(fā)育等很重要[2]。真菌是微生物區(qū)系的重要成員，參與土壤中有機(jī)物的分解、代謝及轉(zhuǎn)化等生化過程，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)健康與否的重要指標(biāo)[3]，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，對根際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究受到了研究者們的高度關(guān)注，已成為土壤微生物學(xué)及土壤生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點之一[4]。陳誠等對健康羊肚菌根際土、爛柄病發(fā)病子實體根際土及相同環(huán)境下未栽培羊肚菌土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)爛柄病的發(fā)生改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)病后根際優(yōu)勢真菌類群為擬青霉屬(Paecilomyces)、木霉屬(Trichoderma)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)及枝頂孢屬(Acremonium)等[5]。許自成等采用PCR-DGGE技術(shù)，對輪作、連作3年、連作6年烤煙根際土壤不同生育期真菌群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)無論是輪作還是連作，烤煙生育中后期土壤真菌群落最為豐富，且連作明顯改變了烤煙根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，隨著連作年限的增加影響越大[6]?！颈狙芯壳腥朦c】這些研究將有助于人們進(jìn)一步掌握不同植株根際微生物種群分布及其消長規(guī)律，從而有針對性地改善根際土壤理化性質(zhì)，改良作物根際真菌群落結(jié)構(gòu)，提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量。【擬解決的關(guān)鍵問題】鑒于此，本研究采用高通量測序技術(shù)，對不同生育期梔子根際土壤真菌群落的動態(tài)變化趨勢進(jìn)行分析，觀察梔子生長過程中根際微生物環(huán)境的變化，為梔子的高效栽培、豐產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)和病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品采集

采樣地點位于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)沙子堡梔子栽培基地，土壤為沙壤土，pH值5.1，含有機(jī)質(zhì)31.53 g/kg、堿解氮89.9 mg/kg、有效磷1.06 mg/kg、速效鉀96.79 mg/kg。分別于梔子的花蕾期(M1)、盛花期(M2)、果實膨大期(M3)及盛果期(M4)的晴天上午10:00左右采集土樣。采用五點“S”型取樣法，隨機(jī)選擇長勢一致的梔子，將其連同根部土壤一同拔出，抖去大的土塊，用毛刷收集須根上的根際土。土樣混勻后置于自封袋中，迅速帶回實驗室于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 土壤總DNA的提取及高通量測序

采用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，U.S.)提取土壤總DNA。利用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸分光光度計檢測DNA的濃度和純度，保證樣品DNA的A260/A280值在1.8～2.0。然后以提取的土壤基因組DNA為模板，分別采用引物ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)域。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35次；72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用AXYGEN公司的膠回收試劑盒對目標(biāo)片段進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物送至北京百邁克生物科技有限公司，利用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3 序列處理與分析

對高通量測序得到的原始序列進(jìn)行雙端拼接、過濾和去除嵌合體，得到優(yōu)化序列，同時對其質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾；然后將優(yōu)化序列在97 %的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTUs(operational taxonomic units)，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類。基于OTU分析結(jié)果，對樣品在各個分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得各樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)圖、物種聚類熱圖、屬分類學(xué)水平系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹及分類學(xué)樹狀圖。最后通過Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、差異優(yōu)勢菌群等分析，評估梔子不同生育期根際真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異，以期揭示不同生育期梔子根際真菌群落組成的動態(tài)變化。以上分析均在北京百邁克生物科技有限公司BMKCloud云平臺網(wǎng)站(http://console.biocloud.net)上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)及OTU數(shù)

從表1可見，4組樣品測序共獲得295 470條原始序列，原始序列經(jīng)拼接、過濾后共產(chǎn)生278 109條有效序列，每個樣品至少產(chǎn)生60 630條有效序列。對有效序列在97 %的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得每個時期樣品的OTU數(shù)，梔子4個生育期的土壤樣品共產(chǎn)生2073個OTU，其中，M1的OTU最多，為683個，M2的OTU最少，為414個。從圖1可見，4個樣本共有的OUT為238個，M1、M2、M3、M4特有的OTU分別為404、149、241、160個，其余OTU為樣本兩兩共有。其中，M1樣本中特有的OTU數(shù)目最多，預(yù)示著該時期根際土壤中存在較多的特有微生物種類；M1和M2共有的OTU數(shù)目最多，為680個，說明這兩個時期土壤中共有的微生物類群最多。

表1 梔子各生育期根際土壤真菌的高通量測序數(shù)據(jù)及OTU量

圖1 不同區(qū)組根際土壤真菌OTUs韋恩圖Fig.1 OTUs Venn diagram of fungal community in different soil compartments

2.2 根際真菌群落組成分析

2.2.1 門水平 不同時期梔子根際土壤真菌在門水平上排名前十的群落組成如圖2所示，4組土壤樣品中的優(yōu)勢菌群主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)，但各菌群在每組樣品中所占的比例稍有差異。其中，子囊菌門相對豐度最高，占4個時期樣品中的比例分別為49.74 %、53.80 %、38.04 %和54.08 %；其次為擔(dān)子菌門，比例分別為20.39 %、8.96 %、13.42 %和42.37 %；被孢霉門相對豐度依次為7.13 %、30.69 %、24.13 %、0.34 %；而其他菌類相對豐度較低，如球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、隱真菌門(Rozellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)等。不同時期梔子根際土壤真菌的群落組成及相對豐度有一定的差異，其中，M1樣品物種組成最為豐富，在門水平上的

圖2 梔子不同生育期土壤真菌的門水平群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.2 Structure and distribution of soil microbial community at phylum level at different growth stages of Gardenia

物種種類最多；被孢霉門在M1、M2和M3樣品中占優(yōu)勢，在M4樣品中則明顯占劣勢；擔(dān)子菌門則在M4樣品中占絕對優(yōu)勢。表明不同生育期梔子根際土壤真菌群落組成各不相同，子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉門為三大優(yōu)勢菌群，三者豐度之和達(dá)78 %以上，而其它真菌類群為非優(yōu)勢菌群。

2.2.2 屬水平 由圖3可以看出，4個時期梔子根際真菌群落在屬水平上豐度較高的真菌主要有被孢霉屬(Mortierella)、木霉屬(Trichoderma)、乳菇屬(Lactarius)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)及枝孢菌屬(Cladosporium)等。各樣品的優(yōu)勢菌屬(相對豐度>10 %)存在一定差異，如在M4樣品中被孢霉屬、輪枝菌屬(Verticillium)和青霉屬相對豐度較其余3個時期小(相對豐度不足1 %)，而木霉屬和乳菇屬的相對豐度則比其余3個時期大(相對豐度超過30 %)。

圖3 梔子不同生育期土壤真菌的屬水平群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.3 Structure and distribution of soil microbial community at genus level at different growth stages of Gardenia

2.3 不同生育期梔子根際優(yōu)勢真菌差異分析

以不同生育期梔子根際土壤真菌類群為對象，使用LEfSe分析梔子不同生育期根際真菌群落中主要差異物種(LDA Score預(yù)設(shè)值4.0，高于4.0視為有顯著差異)，結(jié)果見圖4。圖中LDA Score的絕對值代表差異物種的影響大小，LDA值越大，代表菌群差異性越大。梔子在每個生育期根際土壤中均存在有統(tǒng)計學(xué)差異的物種，銀耳綱(Tremellomycetes)、糞殼菌目(Sordariales)、Trimorphomycetaceae科等真菌群落在M1樣品中豐度較高；叢赤殼科(Nectriaceae)和鐮刀菌屬(Fusarium)在M2樣品中豐度較高；柔膜菌目(Helotiales)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)和Plectosphaerellaceae科等在M3樣品中存在豐富；而哈茨木霉(Trichoderma_virens)、紅菇科(Russulaceae)、肉座菌目(Hypocreales)和乳菇屬(Lactarius)等在M4樣品中相對豐度較高。

圖4 梔子根際土壤真菌LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of rhizosphere fungi of Gardenia

2.4 優(yōu)勢菌群功能分析

對梔子不同生育期根際優(yōu)勢真菌及其功能進(jìn)行統(tǒng)計(表2)。在梔子的4個生育期中，優(yōu)勢真菌主要集中在子囊菌門、半知菌門和擔(dān)子菌門所屬的多個綱、目、科中。每個時期樣品中的優(yōu)勢菌屬各不相同，其中，大孢圓孢霉屬在M1樣品中為優(yōu)勢菌群，鐮刀菌屬在M2樣品中為優(yōu)勢菌屬，柔膜菌目和Verticilliumleptobactrum在M3樣品中為優(yōu)勢菌群，哈茨木霉、嗜熱子囊菌屬及Lactariushorakii在M4樣品中為優(yōu)勢菌屬。在梔子的不同生育期，均存在一些益生微生物，這些微生物的功能主要是促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)作物對病原微生物的抵抗力，或與植物共生、產(chǎn)生一些促進(jìn)作物生長的調(diào)節(jié)劑；同時也存在一些有害微生物，這部分微生物可誘發(fā)作物發(fā)生病害。

表2 梔子根際優(yōu)勢菌群及其功能

2.5 多樣性分析

2.5.1 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性反映的是樣品內(nèi)物種豐度(richness)及物種多樣性(diversity)，本實驗使用Mothur(version v.1.30)軟件，對樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行了評估。各樣品在相似度為97 %水平下的稀釋曲線見圖5，每組樣品稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明樣品序列充分、取樣合理，可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。從梔子不同生育期樣品Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果(表3)可以看出，所有樣品OTU覆蓋率Coverage指數(shù)均高于99 %，說明樣本中物種被測出的概率較高，本次測序結(jié)果能較真實地反映樣本中微生物的存在情況。花蕾期ACE和chao1值最高，花蕾期和盛花期相近，開花過后逐漸降低，說明花蕾期土壤微生物的物種總數(shù)最多，隨著梔子結(jié)果期的到來，物種變得越來越稀少。隨著生育期的推進(jìn)，Shannon指數(shù)在盛果期M1達(dá)到最大，Simpson指數(shù)最小，說明該時期土壤樣品中的物種多樣性最高。

表3 梔子不同生育期樣品Alpha多樣性指數(shù)分析

圖5 相似度為97 %水平下各土壤樣品的稀釋曲線Fig.5 Rarefaction curves of each soil sample at cutoff level of 3 %

2.5.2 Beta多樣性分析 使用QIIME軟件進(jìn)行Beta多樣性分析，比較不同生育期梔子根際真菌群落在物種多樣性方面存在的相似程度。主坐標(biāo)PCoA分析、非度量多維標(biāo)定法(NMDS)分析分別見圖6-a～b，由圖可知，M1和M2期的樣品在坐標(biāo)圖上的距離最近，均分布于同一象限內(nèi)，說明這2個時期的樣品相似性最高，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)最為相似。

圖6 梔子不同生育期根際真菌的PCoA分析(a)和NMDS分析(b)Fig.6 PCoA analysis (a) and NMDS analysis (b) of rhizosphere fungi of Gardenia at different growth stages

采用非加權(quán)配對平均法(UPGMA)對樣品進(jìn)行屬水平上的聚類，來判斷不同生育期梔子根際土壤真菌群落組成的相似性。樣品屬水平的聚類樹見圖7，即總體可分為兩類，M1、M2和M3樣品聚為一類，M4樣品單獨聚為一類，且M1和M2樣品最為靠近，枝長最短，說明這兩個時期樣品的物種組成最相似。

圖7 根際土壤真菌屬水平的UPGMA聚類分析Fig.7 UPGMA cluster analysis of soil rhizosphere fungal

3 討 論

微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)占有重要地位，其多樣性是表征土壤群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因子。微生物多樣性受植被、地理位置、土壤層次、土壤肥力、土壤類型及氣候變化等因素影響[15]，同時土壤微生物多樣性在土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能中起著重要作用。而真菌作為土壤中的一類真核微生物，其種類繁多、分布廣泛，且參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解，能夠為作物生長提供必須的養(yǎng)分，因此，土壤環(huán)境中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化對土壤質(zhì)量具有重要影響。本研究借助高通量測序技術(shù)，對不同生育期梔子根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，梔子根際土壤真菌的OUT數(shù)量、群落豐富度指數(shù)ACE和Chao1、群落多樣性指數(shù)Shannon和Simpson都表現(xiàn)為花蕾期>盛花期>果實膨大期>盛果期，且花蕾期樣品中特有微生物種類最多，說明梔子花蕾期根際真菌的群落多樣性最高，隨著生育期的推進(jìn)多樣性逐漸降低，這一結(jié)果與以往報道相類似[16]。根系分泌物是根際微生物的主要物質(zhì)和能量來源[17]，不同植物種類及同一植物在不同生長發(fā)育階段，其根系分泌物的種類和數(shù)量均有一定的差異，此種差異又直接影響了根際微生物的群落組成[18]。在花蕾期和盛花期，梔子生殖生長和營養(yǎng)生長旺盛，根系生長代謝活躍，促進(jìn)了植株根系分泌物增多，進(jìn)而刺激了根際微生物的繁殖。而當(dāng)梔子進(jìn)入盛果期，植株代謝活動減弱，根際微生物數(shù)量和多樣性又逐漸降低，該結(jié)果與趙柏霞等[19]研究結(jié)果一致。

不同生育期梔子根際真菌群落組成結(jié)果顯示，4組土壤樣品中的優(yōu)勢菌群主要包括子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉門，各菌群在每組樣品中所占的比例稍有差異，其中，被孢霉門在前3個時期樣品中占優(yōu)勢，在盛果期樣品中則明顯占劣勢；而擔(dān)子菌門則在盛果期樣品中占絕對優(yōu)勢。屬水平的根際真菌群落組成分析顯示，4個時期梔子根際優(yōu)勢真菌屬(相對豐度>10 %)主要有被孢霉屬、木霉屬及乳菇屬等，各樣品的優(yōu)勢菌屬存在一定差異，在盛果期樣品中被孢霉屬、輪枝菌屬(Verticillium)和青霉屬(Penicillium)相對豐度較其余3個時期小(相對豐度不足1 %)，而木霉屬和乳菇屬(Lactarius)的相對豐度則比其余3個時期大(相對豐度超過30 %)。這些結(jié)果說明梔子對其根際定殖的土壤真菌具有選擇性，且生育期會影響根際真菌群落的結(jié)構(gòu)和組成。多樣性分析結(jié)果顯示，花蕾期、盛花期及果實膨大期的根際土真菌群落結(jié)構(gòu)相似，與盛果期的根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，這也印證了根際微生物群落受植物生育期的影響，這些真菌之所以能在根際大量定殖可能與其生態(tài)功能有關(guān)[20]。此外，本研究通過對四組樣品的LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)梔子每個生育期根際土壤樣品中都會有一些特有菌群或優(yōu)勢菌群，如銀耳綱、糞殼菌目等真菌群落在M1樣品中豐度較高；叢赤殼科和鐮刀菌屬在M2樣品中豐度較高；柔膜菌目、錘舌菌綱和Plectosphaerellaceae科等在M3樣品中存在豐富；而哈茨木霉、紅菇科、肉座菌目等在M4樣品中相對豐度較高。同時對根際優(yōu)勢真菌功能進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)這些優(yōu)勢真菌主要集中在子囊菌門、半知菌門和擔(dān)子菌門所屬的多個綱、目、科中。其中，益生真菌的主要功能是促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)作物對病原微生物的抵抗力，或與植物共生，產(chǎn)生一些促進(jìn)作物生長的調(diào)節(jié)劑。因此，后續(xù)可通過解析這些益生微生物的促生機(jī)制，進(jìn)而合理開發(fā)和利用這些益生微生物，為梔子的科學(xué)、高效栽培提供理論參考。

4 結(jié) 論

花蕾期梔子根際土壤真菌群落多樣性最高，根際土壤中特有的真菌群落種類最多，隨著生育期的推進(jìn)，物種豐度和多樣性均逐漸降低。

生育期能夠顯著影響梔子根際土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)和組成，有選擇性地富集某些種類的真菌，進(jìn)而形成不同的真菌群落結(jié)構(gòu)。

梔子每個生育期根際優(yōu)勢真菌種類不同，功能迥異，積極地開發(fā)利用其中的益生菌，可以促進(jìn)梔子的高產(chǎn)栽培。