余小芬，線罕英，邱學(xué)禮，鄒炳禮，張素華，劉關(guān)所，張云芬，曾 民，曾黎瓊，楊樹明*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.普洱學(xué)院，云南 普洱 665000；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205；4.石林縣鹿阜街道辦事處農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 石林 652200)

【研究意義】水稻是世界近30億人口的主糧[1]，為緩解人口快速增長及經(jīng)濟(jì)發(fā)展對糧食需求不斷增加的矛盾，提高水稻產(chǎn)量將是保障中國乃至全球糧食安全的有效途徑。盡管中國水稻高產(chǎn)育種已有較大突破，但是各稻作區(qū)的生態(tài)環(huán)境及水稻生產(chǎn)差異較大，低溫與氮素利用率低仍是限制水稻增產(chǎn)的關(guān)鍵因子。據(jù)統(tǒng)計，中國因冷害平均每年損失稻谷30～50億kg[2]，云南常年冷害面積46.7～53.3萬hm2，減產(chǎn)約20 %[3]。為獲高產(chǎn)，部分稻田年均化學(xué)氮肥用量已達(dá)500 kg·hm-2以上[4]，過量施用氮肥不僅增加生產(chǎn)成本，還有加劇環(huán)境污染的風(fēng)險[5]。因此，如何挖掘水稻自身對耐冷、氮素高效利用潛力以緩解低溫對水稻增產(chǎn)的限制，以及高氮用量產(chǎn)生的環(huán)境負(fù)面效應(yīng)，已成為稻作生產(chǎn)中亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在正常溫度下，水稻體內(nèi)氧自由基維持在較低的水平，但受到低溫脅迫時會產(chǎn)生大量的活性氧積累，嚴(yán)重傷害水稻細(xì)胞膜。然而，水稻在受到低溫刺激后，自身能啟動應(yīng)激反應(yīng)，如提高過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性等[6]，進(jìn)而清除產(chǎn)生的過多氧自由基，降低水稻細(xì)胞膜的傷害。低溫會導(dǎo)致水稻葉片丙二醛(MDA)升高，加重膜體系損傷[7]，耐冷越強(qiáng)的品種，MDA增加量越少，作為胞質(zhì)滲壓劑、酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)保護(hù)劑的可溶性糖、可溶性蛋白含量升高，從而增強(qiáng)水稻自身抵抗低溫的能力[8]。在氮素與水稻生理特性方面，施用氮素粒肥可維持水稻葉片較高的SOD、POD酶活性，減少M(fèi)DA的積累和對細(xì)胞膜脂的傷害[9]。葉面噴施有機(jī)氮和無機(jī)氮可提高水稻體內(nèi)POD、CAT酶活性，降低MDA含量，顯著增加可溶性蛋白含量，從而提高水稻產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量[10]。高氮-低溫互作下水稻POD、SOD和CAT活性對低溫的應(yīng)答能力下降，但MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量升高[11]。【本研究切入點(diǎn)】以往研究大多為低溫或氮肥單因素設(shè)計，而關(guān)于低溫與氮耦合對水稻不同生育期的根、葉生理特性的復(fù)合效應(yīng)研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以純系耐冷氮高效I16和冷敏氮低效I67為材料，設(shè)置不同溫度和氮肥因素，系統(tǒng)研究水稻根系和葉片生理指標(biāo)對低溫與氮肥的時段效應(yīng)差異，以期為水稻耐冷、氮高效育種及栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所從云南強(qiáng)耐冷稻種麗江新團(tuán)黑谷近等基因系[十和田×(十和田4/麗江新團(tuán)黑谷BC3F9)]BC4F8群體(105個株系)中篩選的2份近等基因系，即耐冷氮高效I16和耐敏氮低效I67。人工氣候室低溫(17℃)下，I16結(jié)實(shí)率和氮吸收率分別為78.9 %和33.38 %，I67結(jié)實(shí)率和氮吸收率分別為20.5 %和25.75 %[12]。

1.2 水培試驗及低溫處理

水培試驗于2018年在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場進(jìn)行。將供試水稻材料種子浸種消毒2 d后，3月20日播種，田間濕潤育秧，5月3日選取3～4葉期的健壯秧苗，單株移植到容積4 L的水培盆中，每盆3株，注入3 L培養(yǎng)液，每個處理重復(fù)10次，每7 d更換營養(yǎng)液1次，直到試驗結(jié)束。水培營養(yǎng)液參照國際水稻研究所(IRRI)的完全營養(yǎng)液配方[13]，稍加修改配方中的NH4NO3質(zhì)量濃度，設(shè)置極低氮(N10, 10 mg·L-1)、低氮(N20, 20 mg·L-1)、中氮(N40, 40 mg·L-1)、高氮(N60, 60 mg·L-1) 4個氮水平。在水稻移栽后25 d開始在人工氣候室中進(jìn)行低溫(LT)和常溫(NT)處理，低溫和常溫的白天/夜間平均溫度分別為17 ℃/15 ℃和30 ℃/25 ℃，6:00-18:00，18:00-次日6:00，精度±0.5 ℃，設(shè)定相對濕度50 %，室內(nèi)光照與外界自然光照一致，直至成熟。在水稻分蘗期每處理選取正常植株12株掛牌標(biāo)記，供取樣分析。

1.3 測定項目及方法

在水稻分蘗期、孕穗期、開花期和灌漿期分別取標(biāo)記植株根、葉樣品。按照李合生等[14]方法測定POD、CAT、SOD酶活性及MDA、可溶性糖、可溶性蛋白含量，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.4 低溫和氮肥處理的耦合效應(yīng)

參考徐國偉等[15]方法分別計算低溫和氮肥(中氮N40或高氮N60)耦合效應(yīng)。

耦合效應(yīng)=[(低溫與N40或N60-常溫與N10)-(常溫與N40或N60-常溫與N10)-(低溫與N10-常溫與N10)]/2

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫與氮耦合對水稻根、葉生理指標(biāo)的影響

2.1.1 低溫與氮耦合下水稻根、葉POD活性的變化 由圖1～2可知，在相同施氮水平下，與常溫相比，低溫處理后水稻根葉POD活性顯著升高。在2個溫度條件下，根、葉POD活性隨水稻生育進(jìn)程，呈先升高后下降的趨勢。在正常溫度下，根系和葉片POD活性隨著施氮量的增加而增加，而在低溫脅迫下，根、葉POD活性隨著施氮量的增加先升高后降低，說明重施氮肥反而降低根葉POD活性。從不同供試材料和器官比較看，在水稻同一生育期及相同氮水平下，I16的根、葉中POD活性高于I67，葉片高于根系，說明在低溫條件下，耐冷氮高效品種POD活性對氮素的響應(yīng)強(qiáng)于冷敏氮低效品種，葉片響應(yīng)強(qiáng)于根系。

同一時期圖柱上不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著,下同Different lowercase letters in column at the same stage indicate significant difference at P<0.05 level. The same as below

圖2 低溫與氮耦合下水稻葉片POD酶活性的變化Fig.2 Changes of POD activity in leaves of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖3 低溫與氮耦合下水稻根CAT酶活性的變化Fig.3 Changes of CAT activity in roots of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖4 低溫與氮耦合下水稻葉片CAT酶活性的變化Fig.4 Changes of CAT activity in leaves of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖5 低溫與氮耦合下水稻根SOD酶活性的變化Fig.5 Changes of SOD activity in roots of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖6 低溫與氮耦合下水稻葉片SOD酶活性的變化Fig.6 Changes of SOD activity in leaves of rice under the low temperature combined with nitrogen

2.1.2 低溫與氮耦合下水稻根、葉CAT活性的變化 由圖3～4可知，在2個溫度條件下，根、葉CAT活性在水稻分蘗期—開花期維持較高活性，灌漿期顯著下降。在相同施氮水平下，與常溫相比，低溫處理提高了水稻根葉CAT活性。在2個溫度條件下，水稻根系和葉片CAT活性均隨著施氮量的增加而增加，但不同材料最強(qiáng)CAT活性所需施氮水平不同：I16和I67根葉中CAT活性分別以中氮、高氮最強(qiáng)，說明輕施氮肥促進(jìn)耐冷氮高效品種根、葉CAT活性的提升，其耐冷性增強(qiáng)。

2.1.3 低溫與氮耦合下水稻根、葉SOD活性的變化 由圖5～6可知，在相同施氮水平下，與常溫相比，低溫條件下水稻根葉SOD活性顯著升高。從生育進(jìn)程看，水稻根中SOD活性以開花期、灌漿期最高，葉片中SOD活性在水稻分蘗期—開花期最高。在2個溫度條件下，水稻根系和葉片SOD活性均隨施氮量的增加而增加，但在正常溫度下，I16和I67根葉中SOD活性均以高氮最強(qiáng)；而在低溫下，I16和I67根葉中SOD活性分別以中氮、高氮最強(qiáng)，說明輕施氮肥更能增強(qiáng)耐冷氮高效品種根、葉SOD活性，緩解水稻低溫危害。

2.1.4 低溫與氮耦合下水稻根、葉MDA含量的變化 由圖7～8可知，與常溫相比，低溫使水稻根葉MDA含量升高。從生育進(jìn)程看，I16根葉中MDA含量以分蘗期最高，隨后保持相對較低水平，而I67根葉中MDA含量在分蘗期—灌漿期均保持相對較高，在相同生育期及氮水平下，葉片MDA含量高于根系。在正常溫度下，水稻根系和葉片MDA含量隨施氮量的增加而增加，以高氮處理MDA含量最高；在低溫脅迫下，根系和葉片MDA含量隨施氮量增加呈先下降后升高的趨勢，以低氮、中氮處理的MDA含量最低，說明重施氮肥促進(jìn)MDA含量升高，加重水稻低溫冷害。

圖7 低溫與氮耦合下水稻根MDA含量的變化Fig.7 Changes of MDA contents in roots of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖8 低溫與氮耦合下水稻葉片MDA含量的變化Fig.8 Changes of MDA contents in leaves of rice under the low temperature combined with nitrogen

2.1.5 低溫與氮耦合下水稻根、葉可溶性糖含量的變化 由圖9～10可知，與常溫相比，低溫下水稻根葉可溶性糖含量升高。從生育進(jìn)程看，I16根葉中可溶性糖含量以分蘗期、孕穗期較高，開花期和灌漿期顯著下降；而I67根葉中可溶性糖含量在孕穗期和灌漿期均保持相對較高水平，灌漿期逐漸下降。在相同生育進(jìn)程及施氮水平下，葉片可溶性糖含量高于根系。在正常溫度下，水稻根葉的可溶性糖含量隨施氮量的增加而增加，以高氮處理可溶性糖含量最高；在低溫脅迫下，I16根系和葉片可溶性糖含量隨施氮量增加呈先升高后下降的趨勢，以中氮處理最高，而I67根葉可溶性糖含量則隨施氮量增加而增加，高氮處理最高，說明對耐冷氮高效品種輕施氮肥更有利于提高可溶性糖含量。

圖9 低溫與氮耦合下水稻根可溶性糖含量的變化Fig.9 Changes of soluble sugar contents in roots of rice under the low temperature combined with nitrogen

2.1.6 低溫與氮耦合下水稻根、葉可溶性蛋白含量的變化 由圖11～12可知，與常溫相比，低溫條件下水稻根葉可溶性蛋白含量升高。從生育進(jìn)程看，水稻根葉中可溶性蛋白含量在分蘗期—灌漿期維持相對較高水平。在相同生育期及氮水平下，葉片可溶性蛋白含量高于根系。在2個溫度條件下，水稻根系和葉片可溶性蛋白含量隨著施氮量的增加而增加，但I(xiàn)16和I67根葉中可溶性蛋白分別以中氮、高氮最高，說明輕施氮肥更能促進(jìn)耐冷氮高效品種根、葉可溶性蛋白含量的提升，進(jìn)而提高自身的抗逆能力。

圖10 低溫與氮耦合下水稻葉片可溶性糖含量的變化Fig.10 Changes of soluble sugar contents in leaves of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖11 低溫與氮耦合下水稻根可溶性蛋白含量的變化Fig.11 Changes of soluble protein contents in roots of rice under the low temperature combined with nitrogen

圖12 低溫與氮耦合下水稻葉片可溶性蛋白含量的變化Fig.12 Changes of soluble protein contents in leaves of rice under the low temperature combined with nitrogen

2.2 低溫與氮耦合對水稻根、葉生理指標(biāo)耦合效應(yīng)的影響

由表1可知，低溫與氮耦合效應(yīng)因不同品種類型和器官、生理指標(biāo)及生育時段存在一定差異。從根系來看，I16的POD、CAT、SOD、可溶性糖和可溶性蛋白的低溫與中氮耦合效應(yīng)表現(xiàn)為正效應(yīng)為主(分蘗期POD、分蘗期和孕穗期CAT除外)，MDA為負(fù)效應(yīng)；而POD、CAT、SOD(分蘗期和灌漿期除外)、可溶性糖和可溶性蛋白的低溫與高氮耦合為負(fù)效應(yīng)，MDA的低溫與高氮耦合表現(xiàn)為正效應(yīng)。I67的POD、CAT、SOD、可溶性糖和可溶性蛋白的低溫與中氮或高氮(開花期POD、開花期和灌漿期CAT除外)耦合效應(yīng)一致，表現(xiàn)為正效應(yīng)，而MDA表現(xiàn)與I16一致。從葉片來看，I16和I67的POD、CAT、SOD、可溶性糖和可溶性蛋白的低溫和中氮耦合效應(yīng)呈現(xiàn)正效應(yīng)，MDA為負(fù)效應(yīng)。但I(xiàn)16與I67的低溫和高氮耦合效應(yīng)存在一定差異，其中I16葉片的POD、CAT、SOD、可溶性糖和可溶性蛋白為負(fù)效應(yīng)，MDA為正效應(yīng)；而I67葉片的POD、CAT、SOD、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白的低溫和高氮耦合效應(yīng)均為正效應(yīng)。綜合分析可知，在低溫下，適宜的施氮量能夠促進(jìn)根、葉中POD、CAT、SOD活性及可溶性糖、可溶性蛋白含量的提升，降低MDA含量。

表1 低溫與氮耦合對根系及葉片生理指標(biāo)耦合效應(yīng)的影響

續(xù)表1 Continued table 1

3 討 論

植物中POD、CAT和SOD活性反映了自身對低溫產(chǎn)生的活性氧(ROS)消除和防御的能力[16]。MDA是細(xì)胞膜過氧化的產(chǎn)物，其含量高低是判斷脂膜受損的重要指標(biāo)，而可溶性糖、可溶性蛋白對細(xì)胞具有滲透調(diào)節(jié)及保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。研究表明，輕度或短暫的低溫脅迫使水稻產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而提高抗氧化酶的活性，清除產(chǎn)生過多的氧自由基，減輕低溫傷害，但隨著低溫處理強(qiáng)度和持續(xù)時間的增加，抗氧化酶活性下降，低溫傷害加重[17]。低溫可導(dǎo)致水稻葉片MDA、可溶性糖、可溶性蛋白含量升高，其中過多的MDA會抑制植物抗氧化酶活性系統(tǒng)功能，促進(jìn)膜脂氧化，而遭遇低溫脅迫后水稻迅速積累的可溶性糖、可溶性蛋白含量，可為非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)[18-19]和抗氧化酶的合成提供充足的碳源和氮源，以增強(qiáng)稻株抗倒伏能力和體內(nèi)活性氧機(jī)能，從而提高水稻自身抗逆能力[20]。通過研究表明，低溫導(dǎo)致水稻根葉的POD、CAT、SOD活性及MDA、可溶性糖、可溶性蛋白含量顯著增加，且葉片各指標(biāo)變化幅度高于根系，說明水稻已啟動應(yīng)激反應(yīng)，且提高防御活性氧的酶促和非酶促保護(hù)系統(tǒng)物質(zhì)葉片較根系強(qiáng)。與冷敏氮低效I67相比，耐冷氮高效I16從分蘗期低溫開始至開花期，根葉中始終保持相對較高的抗氧化酶活性及可溶性糖、可溶性蛋白含量，以及較低的MDA含量，這可能是耐冷品種與冷敏品種耐冷性的內(nèi)在機(jī)理差異之一。

通過研究表明，在常溫下，I16和I67的根葉中抗氧化物酶活性及MDA、可溶性糖、可溶性蛋白含量均隨施氮量的增加而增加，但在低溫條件下，僅有I67出現(xiàn)類似的結(jié)果，而I16的各項生理指標(biāo)則以中氮最佳，重施氮肥反而降低POD、CAT 、SOD酶活性及可溶性糖、可溶性蛋白含量，顯著增加MDA含量，前人研究有相一致的結(jié)果，即高氮素加重水稻危害是由于高氮素增加了MDA含量，降低了抗氧化物酶活性所致[9,11]。筆者用相同的麗江新團(tuán)黑谷近等基因系群體，在低溫與3個氮水平下，定位到與POD、CAT、MDA、可溶性糖及可溶性蛋白相關(guān)的QTL 27個，貢獻(xiàn)率為9.27 %～29.14 %[3]。可見在寒冷稻作區(qū)的生產(chǎn)實(shí)踐中，培育耐冷氮高效品種的基礎(chǔ)上，適當(dāng)調(diào)控施氮量是同步提高水稻抗低溫的能力及緩解氮肥對土壤和水體污染的重要措施。

4 結(jié) 論

在低溫條件下，適宜氮肥能夠促進(jìn)根、葉中POD、CAT、SOD活性及可溶性糖、可溶性蛋白含量的提升，降低MDA含量，這是施氮增強(qiáng)水稻耐冷性的內(nèi)在機(jī)理之一。低溫與氮耦合效應(yīng)表現(xiàn)為耐冷氮高效品種強(qiáng)于冷敏氮低效品種，葉片強(qiáng)于根系。