余方偉，王神云，張 偉，王 紅，于 利，李建斌

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210014)

【研究意義】根腫病(clubroot disease)是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)引起的世界性土傳病害，該病原菌的寄主范圍十分廣泛，可危害甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、薺菜等多種十字花科栽培和野生植物[1]。根腫病常年危害面積約320～400萬hm2，大流行年份發(fā)生與危害面積可達(dá)900萬hm2，平均產(chǎn)量損失達(dá)20 %～30 %，病重田塊直接產(chǎn)量損失達(dá)60 %以上[2]。除了直接導(dǎo)致作物減產(chǎn)外，病根中釋放的休眠孢子生命力極強(qiáng)可在土壤中存活達(dá)20年[3]，由于目前尚無有效的方法來清除土壤中的休眠孢子，因此在染菌的田塊反復(fù)種植十字花科作物將有極大的減產(chǎn)風(fēng)險?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蕓薹根腫菌的侵染過程主要分為根毛侵染和皮層侵染兩個階段[3-4]：在初侵染階段，初級游動孢子從萌發(fā)的休眠孢子中釋放出來后，受到某種寄主化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)，吸附到寄主植物根毛表面，然后利用特殊的侵染結(jié)構(gòu)排孢管(Stachel and Rohr)穿透宿主細(xì)胞壁，并將變形蟲樣的原生質(zhì)注入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過多次細(xì)胞分裂形成初生原生質(zhì)團(tuán)[5]。經(jīng)過多次十字形細(xì)胞核分裂以后，初生原生質(zhì)團(tuán)逐漸發(fā)育成游動孢子囊。在皮層侵染階段，游動孢子囊釋放出的次生游動孢子侵染根皮層細(xì)胞，并發(fā)育成次生原生質(zhì)團(tuán)。次生原生質(zhì)團(tuán)引起寄主細(xì)胞的異常增大和分裂，導(dǎo)致植物根部腫大和植株地上部分的萎蔫、矮化、黃化、早衰[6-7]。蕓薹根腫菌在寄主植物內(nèi)發(fā)育形成成熟的休眠孢子，隨腐爛的病殘體進(jìn)入土壤中，適時再次成為侵染源。相比侵染過程研究，蕓薹根腫菌致病分子機(jī)理研究較為滯后?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于蕓薹根腫菌以活體營養(yǎng)的方式寄生在寄主細(xì)胞內(nèi)，目前缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，因此傳統(tǒng)的反向遺傳方法研究基因功能也難以在蕓薹根腫菌上應(yīng)用。越來越多的研究表明病原物的分泌蛋白在其致病過程中起到重要作用，而蕓薹根腫菌分泌蛋白的鑒定僅有少量報道[8-11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了進(jìn)一步挖掘鑒定蕓薹根腫菌的潛在分泌蛋白，本研究以湖北長陽火燒坪4號生理小種為實(shí)驗(yàn)材料，采用生物信息學(xué)結(jié)合異源表達(dá)的方法對PbSP1進(jìn)行了克隆和分析，拓展蕓薹根腫菌分泌蛋白研究，加深對蕓薹根腫菌分泌蛋白的科學(xué)認(rèn)知。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源 根腫病樣采自湖北長陽火燒坪，生理小種為4號，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 植物材料 野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana, Col-0)和本氏煙(Nicotianabenthamiana)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕓薹根腫菌的接種 擬南芥接種方法參考Ludwig-Müller等[9]的報道。病根打成勻漿后，用孔徑25 μm的過濾篩過濾，2500 g，10 min離心2次。將休眠孢子濃度調(diào)至約106個孢子/mL，用注射器向14 d苗齡的擬南芥根部周圍注射2 mL上述孢子懸液。將接種后的擬南芥至于23 ℃ ± 1 ℃，16 h光照，8 h黑暗的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 蕓薹根腫菌的核酸提取 基因組DNA提?。喝M南芥病根用無菌水洗滌，用吸水紙吸干后置于液氮中充分研磨，用NuClean Plant Genomic DNA kit試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)按照說明書進(jìn)核酸提取。

RNA提?。喝M南芥病根用無菌水洗滌，用吸水紙吸干后置于液氮中充分研磨，用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)按照說明書進(jìn)行RNA提取。使用PrimeScript cDNA合成試劑盒(寶生物工程有限公司)按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所得產(chǎn)物用作后續(xù)載體構(gòu)建的模板。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 PbSP1(PBRA_001430)的Genbank登錄號為CEP00376.1，該序列源自Schwelm等[12]報道的蕓薹根腫菌菌株e3的參考基因組。通過SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)進(jìn)行信號肽的預(yù)測。使用TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。

1.2.4 測序分析 用正向引物5’-TGAGCGTGTTCCACACAGCA-3’和反向引物:5’-TCTGCTTGCCACTACCTACA-3’，以1.2.2獲得的基因組DNA為模板，使用KOD FX Neo(東洋紡)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μl)如下：25 μl 2×buffer, 5 μl dNTPs (2 mM), 1 μl 模板, 各加2 μl上下游引物(10 μM), 0.5 μl KOD FX Neo, 14.5 μl ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃ 變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,循環(huán)30次后72 ℃反應(yīng)7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1 % 瓊脂糖膠確認(rèn)特異性后送測序。

1.2.5 載體構(gòu)建 構(gòu)建驗(yàn)證信號肽的載體方法如下。設(shè)計特異引物F1: 5’-ATGAATTCATGCAGA GCTGGCTTGCGCTGT-3’和R1:5’-ATCTCGAGGCCGGAGCACGACCATGCCAGC-3’，以1.2.2獲得的cDNA為模板，使用KOD FX Neo(東洋紡)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25 μl)如下：12.5 μl 2×buffer, 2.5 μl dNTPs (2 mM), 1 μl cDNA, 各加1 μl上下游引物(10 μM), 0.3 μl KOD FX Neo, 6.7 μl ddH2O。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,循環(huán)30次后72 ℃反應(yīng)5 min。將切膠回收的片段克隆到pSUC2的EcoR I-XhoI位點(diǎn)上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送測序，測序正確的克隆進(jìn)行擴(kuò)繁，提質(zhì)粒備用。

構(gòu)建煙草瞬時表達(dá)的載體方法如下：設(shè)計引物F2: 5’-ATGGTACC ATGGCTTGTAATTGCACGCTGGATGT-3’和R2: 5’-ATGTCGACGTTCGTACAAGCG CCCAGGTGT -3’反應(yīng)體系如上所述。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性30 s,53 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,循環(huán)30次后72 ℃反應(yīng)10 min。將切膠回收的片段克隆到pCAMBIA-35s-GFP的KpnI-SalI位點(diǎn)上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送測序，測序正確的克隆搖菌提質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.6 酵母蔗糖酶實(shí)驗(yàn) 酵母蔗糖酶實(shí)驗(yàn)方法參照Yu等[11]的報道。將重組質(zhì)粒pSUC2轉(zhuǎn)入酵母蔗糖酶缺失菌株YTK12中，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物涂布于SD-W培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～5 d。PBRA_005941預(yù)測信號肽與蔗糖酶融合的重組轉(zhuǎn)化子作為陰性對照(NK)，Avr1b的信號肽與蔗糖酶融合的重組轉(zhuǎn)化子作為陽性對照。將長出的酵母菌落轉(zhuǎn)接到CMD-W。將PCR驗(yàn)證為陽性的酵母菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PRAA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母在YPRAA培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)。挑取對應(yīng)的酵母菌落，加入1 mL蔗糖溶液(25 mM蔗糖溶解在0.2 M NaAc，pH 5.0)，然后在37 ℃下孵育30 min。最后加入1 mL 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，用4 % NaOH溶液溶解TTC，配置成0.2 % TTC溶液)。在5 min內(nèi)觀察顏色變化。

1.2.7 煙草瞬時表達(dá) 將菌落PCR驗(yàn)證為陽性的農(nóng)桿菌克隆加入到含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,至于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，5000 r/min離心5 min收集菌體。用10 mM MgCl2重懸5000 r/min離心5 min收集菌體，重復(fù)該步驟一次。用侵染緩沖液(10 mM MgCl2，10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH 5.6)重懸菌，稀釋到OD600為0.5，28 ℃黑暗放置2～3 h后用去針頭的1 mL注射器從煙草葉片的背面進(jìn)行注射，在注射后3～5 d觀察GFP熒光。轉(zhuǎn)化空載體pCAMBIA-35s-GFP的葉片用作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbSP1序列分析

為了便于測序，在設(shè)計測序引物時往目的基因的上下游各延伸了100 bp，因此目的條帶會比基因本身大200 bp (圖1-a)。剔除掉兩端多余序列后，通過序列比對發(fā)現(xiàn)從4號小種中擴(kuò)增出來的PbSP1的核酸序列與蕓薹根腫菌歐洲菌株e3參考基因組中相應(yīng)的序列(PBRA_001430)大小相同，都為558 bp，且該基因無內(nèi)含子(圖1-b)。

seq_1為e3菌株序列，seq_2,seq_3, seq_4為擴(kuò)增序列，DNA marker從上到下依次為2000、 1000、 750、 500、 250、 100 bp

2.2 PbSP1的信號肽功能分析

用SignalP 4.1和SMART分別對PbSP1的氨基酸序列進(jìn)行分析(圖2-a)。PbSP1包含185個氨基酸殘基，在其氨基端(1～19 aa)存在1個信號肽,分別在20～57 aa, 58～97 aa,100～140 aa, 146～183 aa處均存在一個Kazal結(jié)構(gòu)域。此外，通過TMHMM v2.0分析未發(fā)現(xiàn)PbSP1存在膜定位序列。因PbSP1存在一個氨基端信號肽，推測該蛋白可以被分泌到胞外。通過酵母蔗糖酶分泌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖 2-b)，轉(zhuǎn)入PbSP1信號肽序列的YTK12能夠在YPRAA上正常生長，也能將TTC還原成紅色不溶物甲臜。上述結(jié)果表明PbSP1第1～19位的氨基酸序列(1～19)具有信號肽功能。

圖2 PbSP1信號肽功能驗(yàn)證Fig.2 Validation of signal peptide of PbSP1 by yeast invertase assay

2.3 PbSP1的表達(dá)特征

根據(jù)Schwelm等[12]公布的表達(dá)量原始數(shù)據(jù)計算出FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)后，本研究進(jìn)一步對PbSP1的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。如圖3所示，PbSP1在休眠孢子萌發(fā)期的表達(dá)量最為活躍，在原生質(zhì)團(tuán)時期和休眠孢子成熟期表達(dá)相對較低，在不同的植物寄主中，PbSP1在油菜中的表達(dá)量較高，白菜次之，在甘藍(lán)中表達(dá)量較低。

G.休眠孢子萌發(fā)期，P.原生質(zhì)團(tuán)，M.休眠孢子成熟期，Bn.油菜， Bo.甘藍(lán)，Br.白菜

2.4 PbSP1的亞細(xì)胞定位分析

合適的細(xì)胞定位是蛋白發(fā)揮正常功能的必要條件。本研究通過煙草瞬時表達(dá)進(jìn)一步明確PbSP1的亞細(xì)胞定位。如圖4所示，在煙草的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯的綠色熒光信號，表明PbSP1分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

圖4 PbSP1的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of PbSP1

3 討 論

研究表明，分泌蛋白在病原物與寄主互作過程中發(fā)揮重要作用[13],因此挖掘鑒定蕓薹根腫菌的分泌蛋白具有重要科學(xué)意義。蕓薹根腫菌的遺傳不可操作性極大地阻礙了其分泌蛋白的鑒定。隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，許多植物病原體的基因組相繼公布。2015年蕓薹根腫菌e3菌株的基因組公布[12]，給相關(guān)基因的克隆和鑒定帶來了便利。本研究通過生物信息學(xué)和異源表達(dá)技術(shù)對蕓薹根腫菌的分泌蛋白PbSP1進(jìn)行了分析。測序結(jié)果表明PbSP1序列與e3菌株相同，且無內(nèi)含子。本研究發(fā)現(xiàn)PbSP1在氨基端存在信號肽，且其他區(qū)域不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，這些特征與已經(jīng)報道的其他病原的分泌蛋白相符合，此外PbSP1還存在4個Kazal結(jié)構(gòu)域。在致病疫霉(Phytophthorainfestans)中，含有Kazal結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白具有絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性，可以抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)[14]。PbSP1在休眠孢子萌發(fā)期表達(dá)量最高，表明其可能在此階段發(fā)揮重要功能。

多數(shù)活體營養(yǎng)型病原物缺乏穩(wěn)定的反向遺傳操作方法，異源表達(dá)技術(shù)成為研究其基因功能的重要手段。通過酵母和大腸桿菌表達(dá)分別揭示了蕓薹根腫菌Pro1的蛋白酶活性[8]，PbBSMT的甲基轉(zhuǎn)移酶活性[9]，通過煙草瞬時表達(dá)揭示PbBSMT的亞細(xì)胞定位[10]。本研究也利用了異源表達(dá)技術(shù)研究了PbSP1的信號肽功能和亞細(xì)胞定位。在后續(xù)的研究中需要借助異源表達(dá)技術(shù)來進(jìn)一步闡明PbSP1及其他分泌蛋白在蕓薹根腫菌致病中的作用。

4 結(jié) 論

蕓薹根腫菌PbSP1包含185個氨基酸殘基，在氨基端存在信號肽序列，同時序列中含有Kazal結(jié)構(gòu)域且不含膜定位序列，酵母蔗糖酶實(shí)驗(yàn)表明PbSP1的信號肽具有功能，PbSP1符合分泌蛋白的基本特征。PbSP1在蕓薹根腫菌休眠孢子萌發(fā)時期表達(dá)最為活躍，在此過程中發(fā)揮重要功能。