張 源， 吳 鵬， 李 慧， 羅紅軍， 羅文鴻， 林哲絢

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實驗室， 廣東 汕頭 515041

引 言

銅離子是生物體不可缺少的微量元素。 銅離子參與生物體一些重要的生理過程， 如細胞呼吸、 神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、 抗氧化應(yīng)激和鐵離子的攝取[1]。 人體許多疾病與體內(nèi)銅離子失衡有關(guān)， 如糖尿病、 心血管病[1]、 瘋牛病[2]、 AD病[3]和癌癥[4]等。 神經(jīng)退行性疾病由人體喪失銅藍蛋白的生物活性造成[5]， 有可能與Cu(Ⅰ)的毒性有關(guān)[6]。 腦血栓病人血清小分子蛋白結(jié)合Cu(Ⅱ)含量發(fā)生變化， 同樣會降低血清銅藍蛋白活性[7]。 在生物體內(nèi)， 銅以Cu(Ⅰ)或Cu(Ⅱ)和酶、 蛋白質(zhì)分子以及一些生物小分子如氨基酸絡(luò)合， 通過兩個形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換而得以進行生物化學(xué)反應(yīng)[8]。 當細胞內(nèi)銅濃度過高時, Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)之間的氧化還原反應(yīng)能催化產(chǎn)生毒性的羥自由基， 損傷脂肪、 蛋白質(zhì)、 DNA等生物大分子[9]。 因此， 測定生物體系中的Cu(Ⅰ)或Cu(Ⅱ)， 可以定量了解生物體內(nèi)銅離子價態(tài)的變化， 對研究銅離子形態(tài)失衡有著重要的生理意義。

適宜pH條件下Cu(Ⅱ)與1,10-菲羅啉反應(yīng)形成的Cu(Ⅱ)配合物在光照條件下還原成Cu(Ⅰ)配合物， 可用分光光度法測定試樣中的Cu(Ⅰ)。 在堿性條件下， 1,10-菲羅啉與Cu(Ⅰ)形成的配合物在428 nm處有光吸收， 用三乙醇胺和亞硫酸鈉聯(lián)合保護Cu(Ⅰ)不被氧化， 可在混有Cu(Ⅱ)情況下直接測定Cu(Ⅰ)[10]。 含有Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)離子的樣品與1.5 mmol·L-12-喹啉甲酸鈉鹽于pH 8.7混和后， 用毛細管電泳將兩者分離后由紫外檢測器可分別測定兩者的濃度[11]。 在這些方法文獻中, 測定Cu(Ⅰ)時大多集中在無機樣品中， 且由于這些方法檢測限高， 靈敏度低， 樣品基體不復(fù)雜， 通常不適合測定生物樣品中的痕量Cu(Ⅰ)濃度。 用石墨爐原子吸法(GFAAS)測定銅檢測限低， 靈敏度高， 目前只能定量測定總銅[12]， 無法區(qū)分其中的Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)。

在血清中， 銅藍蛋白能結(jié)合血清中約90%的銅， 銅藍蛋白既可以通過銅轉(zhuǎn)運蛋白Ctr1結(jié)合Cu(Ⅰ)， 也可結(jié)合血清中多余的Cu(Ⅱ)以抑制脂質(zhì)過氧化作用發(fā)生[13]。 銅藍蛋白主要通過其分子中的組氨酸殘基上的氮與半胱酸殘基上的硫與Cu(Ⅰ) 和Cu(Ⅱ)結(jié)合[14]。 在三氯乙酸的變性作用下， 血清中蛋白質(zhì)中的銅可全部釋放出來， 堿性條件下， 用鹽酸羥胺將其中的Cu(Ⅱ)還原為Cu(Ⅰ)， 利用Cu(Ⅰ)和BCA(2,2′-聯(lián)喹啉-2,2′二甲酸)鈉鹽反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物， 可用分光光度法測定血清或生物樣品的總銅[15]。 上述文獻表明， 血清中存在兩種不同價態(tài)的銅， 但迄今為止， 沒有相關(guān)文獻報道血清中Cu(Ⅰ)的定量檢測方法。

本研究利用堿性條件下甘氨酸螯合銅Cu(Ⅱ)溶于水不溶于有機溶劑[16]而亞銅試劑(2,2′-聯(lián)喹啉)與Cu(Ⅰ)形成的絡(luò)合物溶于有機溶劑而難溶于水的性質(zhì)， 通過2,2′-聯(lián)喹啉的有機溶劑處理含甘氨酸的水溶液生物樣本將兩種不同的形態(tài)銅分離在不同的水相和有機相中， 從而可以用GFAAS法測定有機相中的Cu(Ⅰ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AA-7000型原子吸收光譜儀(島津公司， 日本)。 銅空心陰極燈， 波長324.8 nm， 工作電流10 mA， 狹縫寬0.5 nm， 氘燈扣背景技術(shù)， 氣流0.2 L·min-1, 進樣體積20 μL， 峰高定量進樣。 ASC-7000自動進樣器， 涂層石墨管(日本島津公司)， 美國Millipore公司超純水器。 Eppendorf微量移液管。 旋渦振蕩器。 離心機。 所用玻璃和塑料器具用10%HNO3浸泡后用超純水清洗三次。

CuCl標準品(99.999%， 阿拉丁)； 65%HNO3(德國默克優(yōu)級純)； 30%H2O2(德國默克優(yōu)級純)； 正戊醇(德國默克優(yōu)級純)； 1 g·L-1銅標準貯備液(國家鋼鐵材料測試中心)。

1.2 方法

1.2.1 標準品的保存及標準溶液的配制

CuCl標準品開封后， 用10只1 mL塑料管分裝， 小心充入氬氣， 將管內(nèi)空氣驅(qū)凈后用密封膠封好管口， 并儲存于放有硅膠的干燥器中。 配制工作曲線時， 取出其中一管， 稱取CuCl的標準品0.015 6 g置于10 mL容量瓶， 用0.05% 2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液稀釋至刻度線， 即1 000 ppm亞Cu標準溶液。 取100 μL用2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液依次稀釋成10, 1, 0.1和0.01 ppm溶液, 取0.01 ppm溶液1 000 μL置2 mL消化管于95 ℃烘箱烘干(約5 h)， 冷至室溫后分別加入200 μL 65%硝酸和200 μL 30%雙氧水密封， 80 ℃水浴1 h， 冷至室溫后加入1 000 μL 1%HNO3， 上機時用1%HNO3作稀釋劑， 自動進樣器自動稀釋成1， 2， 4， 8， 16 μg·L-1做工作曲線。

1.2.2 甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH配制

處理不含蛋白的中性水溶液樣本時， 所用甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH用 0.05 mol·L-1甘氨酸和0.5 mol·L-1NaOH配至pH為9。 用20%三氯乙酸處理含蛋白的樣本時， 由于三氯乙酸酸性較強， 為了使上機前的樣液pH大約為9， 所用甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH需要配到12.5(按體積比1∶3混合計算)。

1.2.3 樣本收集

宮頸癌血清由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院檢驗室提供， 健康人血清樣本由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心檢驗室提供， 測定前儲存于冰箱-80 ℃。

細胞勻漿液及細胞膜液樣本制備： 人永生化肝細胞HL-7702細胞在DMEM/F12(1∶1，V/V)含10% NCS培養(yǎng)三天后， 去掉培養(yǎng)液， 收集細胞， 甘氨酸-NaOH緩沖溶液(pH， 9.0)洗滌3次。 于-80 ℃冰箱凍融三次破膜后， 15 000 g×30 min離心， 上清為胞漿液， BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。 沉淀再經(jīng)超聲破碎， 用700 μL 2%Triton X-100溶解， 得即細胞膜液， BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。

1.2.4 總Cu(TCu)含量測定

按文獻[17]方法稍加改進： 取100 μL血清(200 μL細胞漿液或細胞膜液)置于6 mL特氟隆消化管， 防塵措施下置烘箱80 ℃敞口烘干(約6 h)， 消解按1.2.1處理， 用1%硝酸稀釋成1 000 μL， 上機用GFAAS法測定總銅。

1.2.5 Cu(Ⅰ)含量測定

400 μL血清(細胞勻漿液、 細胞膜液)與400 μL 20%三氯乙酸混勻， 1 200轉(zhuǎn)離心10 min去蛋白， 取離心后上清液400 μL置5 mL塑料管內(nèi)， 加入1 500 μL pH為12.5的甘氨酸-NaOH緩沖溶液， 混勻后加入1 000 μL 0.05% 2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液， 旋渦振蕩1 min， 靜置分層后取有機層500 μL于6 mL特氟隆消化管， 95 ℃烘箱烘干(約5 h)， 消解按1.2.1處理， 室溫加入600 μL， 上機用GFAAS法測定Cu(Ⅰ)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 Cu(Ⅰ)的絡(luò)合試劑及其絡(luò)合物的有機溶劑選擇

血清中的蛋白經(jīng)三氯乙酸沉淀， 全部銅以兩種不同形態(tài)的銅釋放出來[15]。 其中的Cu(Ⅰ)能與2，2′-聯(lián)喹啉結(jié)合且形成的配合物易溶于有機溶劑而難溶于水。 選用2，2′-聯(lián)喹啉作為Cu(Ⅰ)的絡(luò)合試劑。 考慮正戊醇是一種微溶于水的無毒有機溶劑， 與水混溶后迅速形成均勻的乳濁液， 使得溶解在其中的2，2′-聯(lián)喹啉能充分結(jié)合水相中的Cu(Ⅰ)離子， 形成的Cu(Ⅰ)配合物進入到正戊醇中。 放置后正戊醇由于密度(0.81)比水小， 很快浮在水面上層， 水相與有機相液界面非常清晰， 無須離心。 因此， 本文采用正戊醇作Cu(Ⅰ)試劑的有機溶劑。

2.1.2 Cu(Ⅱ)離子的配合劑選擇及其濃度、 pH選擇

如圖1所示， 用含2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液與10 μg·L-1Cu(Ⅱ)的純水溶液充分蕩時， 有極少量Cu(Ⅱ)從水相轉(zhuǎn)入有機相， 對測定混存的痕量Cu(Ⅰ)時會產(chǎn)生干擾。 產(chǎn)生這種原因， 很可能因Cu(Ⅱ)離子與溶液中OH-或Cl-形成了低極性的配合物。 要減少這種干擾， 就必須降低Cu(Ⅱ)離子從水相轉(zhuǎn)入有機相的量。

甘氨酸分子屬于極性氨基酸， 溶于極性溶劑， 難溶于非極性溶劑 。 甘氨酸能與Cu(Ⅱ)形成穩(wěn)定的無機絡(luò)合劑， 其穩(wěn)定常數(shù)為15.1[18]。 因此選擇甘氨酸作Cu(Ⅱ)離子的配合劑。

圖1 甘氨酸對10 μg·L-1 Cu(Ⅱ)離子由水相進入有機相的影響

圖2為混有8 μg·L-1Cu(Ⅰ)與10 μg·L-1Cu(Ⅱ)兩種離子的水相經(jīng)過甘氨酸和2，2′-聯(lián)喹啉處理后， 轉(zhuǎn)移到有機相中的銅分析結(jié)果。 從圖2中可看出， 在考察的pH范圍中， 8 μg·L-1Cu(Ⅰ)絕大部分能從水相轉(zhuǎn)移到有機相中。 而Cu(Ⅱ)離子只有當緩沖溶液pH≥8時才不會進入到有機相， 說明pH≥8時Cu(Ⅱ)離子對Cu(Ⅰ)離子的測定基本上沒有干擾。

圖2 不同pH甘氨酸-NaOH緩沖溶液對水相中不同價態(tài)銅離子進入有機相的影響

Fig.2 Effects of different pH glycine-NaOH buffer solutions with copper ions entering organic phase

2.2 Cu(Ⅰ)離子的穩(wěn)定性

2.2.1 標準溶液中Cu(Ⅰ)離子的穩(wěn)定性

如圖3所示， 移取5 μg·L-1Cu(Ⅰ)的氯化鉀飽和溶液于10 mL塑料管內(nèi)， 蓋緊管口， 每隔1 h取出1 mL測定Cu(Ⅰ)濃度， 結(jié)果表明， 隨著放置時間延長， Cu(Ⅰ)濃度會漸漸降低， 7 h后濃度幾乎降低了一半。 將Cu(Ⅰ)直接溶于2，2′-聯(lián)喹啉的有機相后， 由于其與配合劑生成穩(wěn)定的配合物， 加上有機溶劑隔絕空氣中的氧， 7 h內(nèi)吸光度幾乎沒有什么變化。 因此， 短期內(nèi)Cu(Ⅰ)標準溶液可用含2，2′-聯(lián)喹啉正戊醇溶液配置。

圖3 室溫放置一天Cu(Ⅰ)在水相及有機相中的濃度變化

2.2.2 生物樣本處理過程中Cu(Ⅰ)離子的穩(wěn)定性

如圖4所示， 將血清樣品分成兩組， 一組-80 ℃低溫冰箱保存， 一組室溫下放置。 每隔一天測血清中的Cu(Ⅰ)濃度， 一周后發(fā)現(xiàn)-80 ℃低溫冰箱的血清Cu(Ⅰ)濃度基本上沒變化， 室溫下的血清Cu(Ⅰ)濃度度降低了近20%。 這可能與保護Cu(Ⅰ)不被氧化的蛋白質(zhì)降解有關(guān)， 由于血清總銅不變， 即部分Cu(Ⅰ)被氧化成了Cu(Ⅱ)。 因此， 測定生物樣品的Cu(Ⅰ)時， 新鮮的血清應(yīng)盡量及時處理， 而對于濃度極低的細胞液或細胞膜液， 則應(yīng)在當天處理。

圖4 血清室溫放置一周的Cu(Ⅰ)濃度變化

2.3 最佳條件下考察Cu(Ⅱ)對Cu(Ⅰ)的干擾情況

圖5為pH為9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液條件下， 10， 100和1 000 μg·L-1的Cu(Ⅱ)離子從水相轉(zhuǎn)移到有機相中， 在有機相中測到的銅濃度值。 結(jié)果表明， 10倍Cu(Ⅱ)離子濃度的存在， 對Cu(Ⅰ)離子的測定不再產(chǎn)生干擾。

圖5 水相中不同濃度的二價銅進入有機相的濃度

2.4 方法的分析性能

按1.2.1方法制作測定銅標準系列， 校準曲線方程為

A=0.048c+0.000 5，R=0.999 5

按3倍空白標準偏差計算方法的檢出限(n=12)， Cu(Ⅰ)的檢出限為0.10 μg·L-1。 將一定質(zhì)量CuCl的標準加入樣品， 按1.2.5方法處理后測定Cu(Ⅰ)， 所得回收率和標準偏差見表1。

表1 方法回收率和標準偏差

2.5 實際樣品分析(n=5)

表2說明， 宮頸癌患者與健康者相比， 血清總銅變化不大， Cu(Ⅰ)濃度明顯偏高。

表3說明， 農(nóng)夫山泉水、 自來水及尿液檢測不到Cu(Ⅰ)， 而細胞液和細胞膜中幾乎沒有Cu(Ⅱ)離子存在。

表2 健康者與宮頸癌患者血清中Cu(Ⅰ)測定結(jié)果比較

表3 幾種樣品的亞銅和總銅含量

3 結(jié) 論

在pH為8～10的條件下， 甘氨酸與Cu(Ⅱ)形成溶于水不溶于有機溶劑的穩(wěn)定配合物甘氨酸銅， 2,2′-聯(lián)喹啉亞銅溶于有機溶劑而不溶于水， 利用此原理能將樣品中同時存在的Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)分離在不同液相， 進而用GFAAS法可以測定血清中Cu(Ⅰ)含量。 本法可用于生物樣品中Cu(Ⅰ)離子的測定， 10倍的Cu(Ⅱ)離子對其測定無干擾。 目前定量測定生物體系中的銅仍然局限在總銅方面。 本文報道μg·L-1級Cu(Ⅰ)含量的檢測， 通過檢測， 可加深認識和了解生物體系中銅形態(tài)的轉(zhuǎn)換及代謝失衡的變化規(guī)律， 對研究老年癡呆、 腫瘤、 炎癥等疾病狀態(tài)下Cu(Ⅰ)是否具有獨自的病理生理意義有一定的意義。