常麗娟，劉文娟，張富麗，王 東，宋 君

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066)

【研究意義】自然界中植物生長受到各種生物脅迫和非生物脅迫的影響，非生物脅迫可分為溫度脅迫、水分脅迫、鹽脅迫、礦物質(zhì)缺乏等因素，是制約植物生長發(fā)育、影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因子。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是我國商業(yè)化種植面積最大的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，20世紀(jì)90年代我國研制了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的第一代轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉，成功抵御住了棉鈴蟲的危害，極大提高了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的市場占有率，國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在遏制棉鈴蟲爆發(fā)、降低農(nóng)藥使用、節(jié)約生產(chǎn)成本等方面取得了世人矚目的成就，帶來了巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究非生物脅迫與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉外源Bt蛋白表達(dá)量的關(guān)系可以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的田間種植，避免環(huán)境因素對抗性的影響，具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】非生物脅迫可導(dǎo)致水稻[1-2]、小麥[3]、玉米[4]等作物花粉藥隔維管束結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致花粉敗育。王曉宇等[5]對小麥幼苗進(jìn)行4種非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)非生物脅迫抑制小麥的生長，植株干枯矮小，根和葉片不同程度變短，根、莖、葉中可溶性總蛋白含量升高。非生物脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉外源蛋白表達(dá)量存在影響。張祥等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件下不同濕度處理4種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，盛蕾期抗蟲棉Bt蛋白含量與CK無差異，盛花期和盛鈴期高溫高濕處理抗蟲棉Bt蛋白含量不同程度下降。王家寶等[7]研究發(fā)現(xiàn)，花鈴期田間漬澇或土壤缺水干旱，可顯著降低棉株不同器官的Bt蛋白含量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)盆栽種植黃河流域和長江流域具有代表性的抗蟲棉品種中棉45號和鄂抗蟲棉1號，同時設(shè)置8種非生物脅迫條件，對2種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根、莖、葉中Bt蛋白含量進(jìn)行檢測。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在探究非生物脅迫對Bt蛋白表達(dá)量的影響，避免不利環(huán)境因素降低轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗性，為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉田間種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料與土壤 試驗(yàn)所用的轉(zhuǎn)Bt 基因抗蟲棉品種由中國農(nóng)科院棉花研究所提供；種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的土壤為大田土壤與市場購買營養(yǎng)土按2∶1配制而成的混合土，土壤pH 6.2～6.8，偏酸性，土壤有機(jī)質(zhì)含量3.56 %，全氮 1.2 g·kg-1，速效磷 12.1 mg·kg-1，速效鉀197.5 mg·kg-1。

1.1.2 試劑與儀器 試驗(yàn)所用BCA總蛋白定量試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；Bt蛋白定量檢測試劑盒購于美國一龍公司。試驗(yàn)所用的儀器有酶標(biāo)儀(μQuant)、人工氣候箱(RXZ-600B)、低溫震蕩培養(yǎng)箱(BSD-250)、賽多利斯電子天平(BS124S)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱盆栽種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，選擇直徑28 cm，高26.5 cm的塑料桶，底層放置厚約5 cm鵝卵石，上層裝入混勻的試驗(yàn)土壤。人工氣候箱溫度37 ℃，光照16 h，黑暗8 h，光照強(qiáng)度66 %，濕度60 %。當(dāng)幼苗生長到4～6葉期，分別進(jìn)行以下處理：①對照：不經(jīng)任何處理，充分灌水(CK)；②溫度脅迫：低溫(4 ℃)、高溫(37 ℃)；③鹽脅迫：0.1、0.2、0.5 mol·L-1NaCl；④水分脅迫：輕度干旱(土壤含水量為田間持水量的60～70 %)、中度干旱(土壤含水量為田間持水量的50 %～60 %)、重度干旱(土壤含水量為田間持水量的40 %～50 %)。參照李彥彬等[8]試驗(yàn)所用的方法進(jìn)行水分梯度設(shè)置和控制土壤水分，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，處理48 h后，取轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的根、莖、葉-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 待測樣品的處理 將采集的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉樣品液氮研磨，每個樣品研磨后迅速稱取0.1 g粉末于離心管中，向離心管中加入1 mL的PBS溶液(由Envirologix試劑盒提供的提取緩沖液粉末溶解后再加5 %的吐溫配置而成)，低溫?fù)u床振蕩12 h，取出樣品放于低溫高速離心機(jī)4 ℃、8000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.2.3 可溶性總蛋白含量的檢測 按照BCA 蛋白含量檢測試劑盒要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線，并稀釋待測樣品的可溶性總蛋白濃度至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將25 μl BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品分別加入到酶標(biāo)板內(nèi)相應(yīng)位置，然后加入BCA 工作液200 μl，充分混勻37 ℃放置30 min后，在562 nm波長下讀取光密度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中可溶性總蛋白的含量。

1.2.4 Bt蛋白含量的檢測 Bt 蛋白含量采用Envirologix試劑盒測定，按照試劑盒說明書，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng·mL-16個濃度梯度，并稀釋待測樣品的Bt 蛋白濃度至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品一起加入酶標(biāo)板內(nèi)相應(yīng)位置，得到相應(yīng)的光密度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中單位鮮重Bt 蛋白的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白含量的影響

對溫度脅迫條件下轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根、莖、葉中Bt蛋白含量進(jìn)行測定(表1)，低溫及高溫脅迫導(dǎo)致Bt蛋白含量下降，高溫下降幅度大于低溫。根、莖中Bt蛋白含量下降較明顯，均與CK差異顯著，中棉45號葉中Bt蛋白含量呈下降趨勢，與CK相比較無差異，鄂抗蟲棉1號下降幅度大，與CK差異達(dá)顯著水平。

表1 溫度脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉蛋白表達(dá)量的影響

2.2 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白含量的影響

對鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根、莖、葉各組織的外源Bt蛋白含量進(jìn)行測定(表2)，與CK相比較，在不同濃度的鹽脅迫條件下，2個抗蟲棉品種的根、莖、葉中Bt蛋白含量先不同程度的下降，在0.1或0.2 mol·L-1鹽濃度處下降到最低，最低點(diǎn)Bt蛋白含量與CK差異達(dá)顯著水平；在0.5 mol·L-1鹽濃度脅迫條件下，Bt蛋白含量快速上升，其中鄂抗蟲棉1號莖、葉中上升幅度最大，Bt蛋白含量高于CK，并與CK差異達(dá)顯著水平。

2.3 水分脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白含量的影響

對水分脅迫條件下轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根、莖、葉中Bt蛋白含量進(jìn)行測定(表3)，不同程度水分脅迫下2個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根、莖、葉中，Bt蛋白含量變化趨勢同鹽脅迫大致相同。與CK相比較，在不同程度水分脅迫條件下，2個抗蟲棉品種的根、莖、葉中Bt蛋白含量先不同程度的下降，在輕度干旱或中度干旱脅迫條件下最低，重度干旱脅迫條件下，Bt蛋白含量快速上升，其中鄂抗蟲棉1號的根、莖中上升幅度最大，Bt蛋白含量高于CK，并與CK差異達(dá)顯著水平。

表3 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

非生物脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白表達(dá)量的影響已有較多報道，其中溫度、鹽、干旱脅迫是田間較常見的非生物脅迫因素。已有研究表明，37 ℃高溫脅迫可導(dǎo)致Bt蛋白表達(dá)量下降，但溫度脅迫對棉花生長后期的影響大于生長前期[9-10]。王永慧等[11]研究發(fā)現(xiàn)，溫度和濕度雙重脅迫可顯著降低抗蟲棉Bt蛋白含量，低溫低濕度脅迫12 h后葉片Bt蛋白含量發(fā)生顯著下降，而高溫低濕度處理脅迫24 h后下降幅度較大。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲棉苗期溫度脅迫48 h后，根、莖、葉中Bt蛋白含量發(fā)生顯著下降，高溫脅迫對Bt蛋白含量的影響大于低溫脅迫。

土壤鹽濃度直接影響抗蟲棉Bt蛋白含量，張桂玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)，10 d短期鹽脅迫可導(dǎo)致抗蟲棉根、莖、葉中的Bt蛋白含量、可溶性蛋白含量均降低，而從播種到四片真葉的長期鹽脅迫可導(dǎo)致抗蟲棉根、莖、葉中的Bt蛋白含量、可溶性蛋白含量均增加。代建龍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫顯著降低抗蟲棉葉片中Bt蛋白含量，但鹽脅迫條件下施氮肥可提高Bt蛋白含量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比較，0.1或0.2 mol·L-1NaCl的鹽脅迫導(dǎo)致抗蟲棉根、莖、葉中Bt蛋白含量不同程度降低，0.5 mol·L-1NaCl鹽濃度脅迫處理后，Bt蛋白含量上升，在鄂抗蟲棉1號的莖、葉中，Bt蛋白含量上升幅度較大，其測量值高于CK，與CK差異達(dá)顯著水平。

水分過高或過低都不利于抗蟲棉Bt蛋白的表達(dá)，周冬生等[14]對抗蟲棉蕾期植株進(jìn)行澇漬和干旱處理，旱澇處理1周后，取抗蟲棉葉片和幼蕾進(jìn)行生物測定，發(fā)現(xiàn)澇漬造成轉(zhuǎn)Bt基因棉抗蟲性的顯著下降，而土壤干旱的影響則相對較小。王俊等[15]在抗蟲棉盛蕾期和盛鈴期進(jìn)行5個梯度的水分脅迫處理，發(fā)現(xiàn)在抗蟲棉蕾和鈴殼中Bt蛋白含量隨土壤含水量的下降而顯著降低。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比較，隨干旱脅迫程度加重，抗蟲棉根、莖、葉中Bt蛋白含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，重度干旱脅迫條件下，鄂抗蟲棉1號的根、莖中，Bt蛋白含量上升幅度較大，與CK差異達(dá)顯著水平。

鹽脅迫和水分脅迫都會導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，2種非生物脅迫的分子機(jī)制都是通過外界信號誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游抗性基因的表達(dá)以提高植物的抗逆性[16]。鹽脅迫和水分脅都可以下調(diào)Bt蛋白的表達(dá)量，其分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫和干旱脅迫條件下，抗蟲棉Bt蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，與前人的研究結(jié)果不一致，造成差異的試驗(yàn)結(jié)果可能有以下兩個因素：①本試驗(yàn)設(shè)置的鹽脅迫濃度和干旱程度范圍大于之前的研究，脅迫時間也不相同。②在測量Bt蛋白含量時，稱取相同質(zhì)量的樣品，由于0.5 mol·L-1鹽濃度和重度干旱脅迫條件下，抗蟲棉細(xì)胞嚴(yán)重失水，葉片萎蔫，稱取樣品量相對較大，因此造成0.5 mol·L-1鹽濃度和重度干旱脅迫條件下Bt蛋白表達(dá)量上升的現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

非生物脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白表達(dá)存在影響，溫度、鹽、干旱都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白表達(dá)量下降，田間種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉要評估環(huán)境因子對抗蟲棉抗性的影響，密切關(guān)注田間抗蟲棉抗性的動態(tài)變化，在抗蟲棉抗性下降田間蟲害爆發(fā)初期及時排除環(huán)境因子的影響，降低害蟲對棉花生產(chǎn)的危害。