董文婷 霍金海 孫國東 王偉明

中圖分類號 R965

文獻標志碼A

文章編號 1001-0408（ 2020）03-0298-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.09

摘要 目的：考察胡桃醌對大鼠腦組織的影響及其與腦組織損傷相關生物標志物的關系。方法：將40只大鼠分為空白組和胡桃醌高、中、低劑量組（34.832、17.416、8.708mg/kg），每組10只，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥4周。末次給藥后，考察各組大鼠的一般行為學、腦指數及腦組織病理形態(tài)。采用超高效液相色譜一多反應檢測質譜（UPLC-MRM-MS）法檢測各組大鼠血清中左旋多巴（L-Dopa）、L-酪氨酸（L-Tyr）、L-色氨酸（L-Trp）的含量。色譜條件為色譜柱Waters Acquity UPLC BEHC¹⁸，流動相為乙酸銨水溶液-乙腈，梯度洗脫，流速為0.3mL/min，選樣量為5μL，柱溫為30 ℃;質譜條件為電噴霧離子源，正離子模式下檢測，毛細管電壓為3500V，去溶劑氣流量為650L/h，去溶劑化溫度為350℃，離子源溫度為110℃。結果：與空白組比較，胡桃醌各劑量組大鼠出現(xiàn)倦怠、四肢無力的行為;腦組織可見大、小腦皮質內血管充血，錐體細胞層部分神經元固縮，核深染，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清晰等病理性改變;胡桃醌高劑量組腦指數顯著增加（P<0.05）。建立的UPLC-MRM-MS法專屬性良好，L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的檢測質量濃度線性范圍分別為31.25～32000、31.25～32000、15.625～16000ng/mL（r=0.9991～0.9999），檢測限分別為6.250、5.625、3.125ng/mL，定量限分別為15.625、18.75、10.00ng/mL，精密度、準確度、穩(wěn)定性（24h）試驗RSD均小于2.6% （n=6），基質效應為95.1%～100.1%（RSD均未超過3.25%，n=3）。動物實驗結果顯示，與空白組比較，胡桃醌中、高劑量組L-Dopa含量顯著升高（P<0.01）;胡桃醌低、中、高劑量組L-Tyr含量顯著升高，L-Trp含量顯著降低（P<0.05或P

關鍵詞 胡桃醌;腦組織;生物標志物;超高效液相色譜一多反應檢測質譜法;含量測定

胡桃楸（Juglans mandshurica）作為一種具有潛在藥用價值的中藥，在我國民間可用于治療腫瘤和減輕腫瘤引起的疼痛，在臨床上也有諸多應用[1-2]。胡桃醌是胡桃楸中重要的活性成分，又名5-羥基-1，4一萘醌[3-4]。近年來關于胡桃醌體外抗腫瘤的研究越來越多，研究發(fā)現(xiàn)，胡桃醌具有抗胃癌、肝癌及肺癌等多種腫瘤的活性，但是由于其具有一定的毒性，且難溶于水，使得其安全性和療效受到影響[5-6]。

本課題組前期基于非靶向代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)胡桃醌可明顯升高正常大鼠血清中左旋多巴（L-Dopa）、L-酪氨酸（L-Tyr）水平，同時降低L-色氨酸（L-Trp）水平，且這3種生物標志物與腦組織正常生理功能密切相關[7-9]?；诖耍P者首先研究胡桃醌作用于大鼠后，其腦指數、腦組織病理切片的變化;然后利用超高效液相色譜一多反應檢測質譜（UPLC-MRM-MS）法，對上述3種生物標志物進行定量分析，明確胡桃醌對3種生物標志物的影響，從生物標志物層面判斷胡桃醌的腦毒性，為其開發(fā)為抗腫瘤新藥的安全性評價奠定基礎。

l 材料

1.1 儀器

ACQUITY型液相色譜系統(tǒng)、XEVO TSQ型三重串聯(lián)四級桿MS儀，配有電噴霧（ESI）離子源以及Masslynx數據處理軟件（美國Waters公司）;DW-86L959型超低溫冰箱（青島海爾集團有限公司）;BSA224S-CW型分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）;ST16R型低溫高速離心機（美國賽默飛公司）;KD-BM型生物組織包埋機（金華科迪儀器設備有限公司）;RM2235型生物組織切片機（德國Lecia公司）;DP72型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試劑

胡桃醌（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：H-075-131230.純度：>98%）;L-Dopa（批號：LRAA9068，純度：≥99.5%）、L-Tyr（批號：SLBN0617V，純度：≥99.5%）、L-Trp（批號：BCBR1025V，純度：≥99.5%）對照品均購自美國Sigma公司;甲醇、乙腈均為色譜純;水為純凈水。

1.3 動物

SPF級Wistar大鼠，雄性，體質量（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0011。動物于室溫22～24℃、濕度40%～70%條件下飼養(yǎng)，期間自由攝食、飲水。

2 方法與結果

2.1 分組、給藥

取40只大鼠，隨機分為空白組和胡桃醌高、中、低劑量組（34.832、17.416、8.708mg/kg，劑量依據預試驗結果確定，開始出現(xiàn)毒性癥狀的劑量為中劑量，再以此確定高、低劑量），每組10只，每天灌胃給藥1次，灌胃體積為2mL/100g，空門組給予等體積純凈水，連續(xù)給藥4周。給藥期間大鼠自由攝食、飲水。

2.2 各組大鼠行為學觀察

對各組大鼠一般行為學進行觀察記錄。結果，與空門組比較，胡桃醌各給藥組大鼠行為活動均有明顯差異：灌胃初期，大鼠出現(xiàn)聳毛、活動減少或不動、不食等現(xiàn)象;灌胃后期，胡桃醌高、中劑量組大鼠逐漸出現(xiàn)呆頓、倦怠瞇眼、精神不佳、軀體癱軟、四肢明顯無力，同時伴有毛色干枯等現(xiàn)象。

2.3 各組大鼠體質量及腦指數的測定

末次灌胃給藥后，稱量大鼠的體質量;處死大鼠，取出腦組織，生理鹽水清洗并用濾紙吸干多余水分，計算腦指數（腦指數=腦質量/體質量Xl00%）。采用SPSS17.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析，數據以 ±5表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。各組大鼠體質量及腦指數的測定結果見表1。

由表1可知，與空門組比較，胡桃醌高、中、低劑量組大鼠體質量顯著下降（P<0.01），胡桃醌高劑量組大鼠腦指數顯著升高（P<0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織病理學觀察

各組大鼠進行腦指數測定實驗后，將大鼠大腦、小腦組織于10%中性甲醛（pH 7.2）固定、組織修切、石蠟包埋、常規(guī)切片、蘇木精一伊紅（HE）染色、酒精梯度脫水、透明、封片，最后于顯微鏡下觀察。各組大鼠腦組織病理學觀察結果見圖1。

由圖1可知，空白組大鼠大腦組織皮層椎體細胞形態(tài)結構完整，胞核清晰，毛細血管未見明顯充血;小腦組織的蒲金野氏細胞層細胞形態(tài)清晰、結構完整、排列規(guī)則，毛細血管未見明顯充血。胡桃醌各劑量組大鼠大腦組織出現(xiàn)皮質內小血管充血，錐體細胞層部分神經元固縮，核深染，形態(tài)不規(guī)整，邊界不清晰，尤其胡桃醌高劑量組現(xiàn)象較為明顯，神經元甚至溶解消失;小腦皮質內小血管充血，部分蒲金野氏細胞的細胞質內可見微小空泡、腫脹，胡桃醌高、中劑量組部分細胞核深染、變小，甚至溶解消失。

2.5 大鼠血清中L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的含量測定

2.5.1 色譜與質譜條件（1）色譜條件。色譜柱為Wa-ters Acquity UPLC BEH C.8色譜柱（100mm×2.1mm.1.7 μm）;流動相為5mmol/L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2min.5%B;2～11min， 5% B→35% B; 11～12.5min， 35% B→l00% B; 12.5～13min，100% B; 13～13.1min， 100%B→5% B; 13.1～15min，5%B）;進樣量為5μL;流速為0.3mL/min;柱溫為30 0C。（2）質譜條件。采用ESI離子源，正離子模式下檢測，毛細管電壓為3500V，去溶劑氣流量為650L/h，去溶劑化溫度350℃，離子源溫度為110℃，MRM掃描測定。L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的MRM條件見表2。

2.5.2 血清樣本處理大鼠末次給藥后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，腹主動脈取血，3000r/min離心10min，取上清加入2倍活性炭，渦旋混合，4℃、13000r/min離心10min，取上清液，經0.45mm微孔濾膜過濾后為空白血清樣本，-80℃低溫保存?zhèn)溆?取各組大鼠血清樣本200μL，加入800μL甲醇，渦旋2min，4℃13000r/min離心10min，定量取800μL的上清液氮氣吹干，用200μL初始流動相復溶，4℃13000r/min離心10min，取上清液備用。

2.5.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取L-Dopa、L-Tyr、L-Trp對照品適量，置于10mL量瓶中，用甲醇制成質量濃度為1mg/mL的標準儲備液，4℃低溫保存待用。精確量取L-Dopa、L-Tyr、L-Trp對照品儲備液適量，用甲醇制成L-Dopa、L-Tyr質量濃度分別為64000、16000、4000、1000、250、62.5ng/mL，L-Trp質量濃度分別為32000、8000、2000、500、125、31.25ng/mL的系列對照品溶液。

2.5.4 專屬性試驗分別取空白血清、空白血清+混合對照品溶液（與L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的對照品溶液適量混合）、末次灌胃給藥后大鼠的血清樣品，按“2.5.2”項下方法處理樣品后，再按“2.5.1”項下的色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果表明，空白血清基質對所測的3種成分不產生影響，各離子通道中的目標待測物未出現(xiàn)明顯的干擾峰，末次灌胃給藥后大鼠的血清樣品中各待測物出峰位置和空白血清加混合對照品的出峰位置一致，說明該方法專屬性較好。樣品總離子流圖見圖2。

2.5.5 線性關系、檢測限及定量限考察取空白血清200μL，加入800μL甲醇，渦旋2min，4℃13000r/min離心10min，定量取800μL的上清液，精密加入“2.5.3”項下系列質量濃度的L-Dopa、L-Tyr、L-Trp對照品溶液100μL，共同氮氣吹干后，用200μL初始流動相復溶，最后制成/-Dopa（ 31.25、125、500、2000、8000、32000ng/mL）、L-Tyr（ 31.25、125、500、2000、8000、32000ng/mL）、L-Trp（ 15.625、62.5、250、1000、4000、16000ng/mL）的系列溶液，按“2.5.1”項下色譜與質譜條件進樣分析。以L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸;另取“2.5.3”項下各對照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋后測定，以信噪比為3：1、10：1計算檢測限、定量限，結果見表3。

2.5.6 精密度試驗取空門血清200μL，加入800μL甲醇，渦旋2min.4℃13000 r/min離心10min，定量取800μL的上清液，精密加入不同質量濃度的L-Dopa、L-Tyr、L-Trp對照品溶液100μL，共同氮氣吹干，200μL初始流動相復溶，分別制成L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的高、中、低質量濃度（4000、2000、1000ng/mL）的血清樣品溶液，以“2.5.1”項下色譜與質譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算日內精密度，以L-Dopa、L-Tyr、L-Trp峰面積計算相應質量濃度，其與真實質量濃度的比值計算準確度。結果，高、中、低質量濃度樣品溶液的L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的日內精密度RSD均未超過2.51%，準確度在93%～100%之間（n=6），符合生物樣品定量分析的相關要求。精密度、準確度結果見表4。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗同“2.5.6”項下方法“取空白血清……200μL初始流動相復溶”，分別制成L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的高、中、低質量濃度（4000、2000、1000ng/mL）的血清樣品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24h后，按“2.5.1”項下色譜與質譜條件進樣分析。結果，高、中、低質量濃度樣品溶液的L-Dopa、L-Tyr、L-Trp峰面積的RSD均小于2.5%（n=6），表明各被測成分24h穩(wěn)定性良好。

2.5.8 基質效應同“2.5.6”項下方法“取空白血清……200μL初始流動相復溶”，分別制成L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的高、中、低質量濃度（4000、2000、1000ng/mL）的血清樣品溶液，按“2.5.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積A;另用初始流動相代替空門血清，配制相同質量濃度的樣品溶液，按“2.5.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積B。按公式計算基質效應：A/B×100%：結果，L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的基質效應在95.1%～100.1%之間，RSD均未超過3.25%（n=6），符合生物樣品定量分析的相關要求，結果見表4。

2.5.9 含量測定 末次給藥后，取各組大鼠血清，按“2.5.2”項下方法處理后，按“2.5.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，計算各組大鼠血清中L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的含量，結果見表5。

由表5可知，與空白組比較，胡桃醌中、高劑量組L-Dopa含量顯著升高（P<0.01）;胡桃醌低、中、高劑量組L-Tyr含量均顯著升高，L-Trp含量均顯著降低（P<0.05或P

3 討論

L-Dopa是生物體腦內一種重要的生物活性物質，是從L-Tyr到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中重要的中間產物，L-Dopa通過血腦屏障脫羧生成多巴胺（DA）;高濃度L-Dopa和DA可通過自身氧化，生成具有高毒性的氧化活性物質，如過氧化氫、超氧自由基、羥自由基等，這些高毒物質超出機體氧化應激平衡，即可攻擊腦組織中細胞膜上的多聚不飽和脂肪酸，產生脂質過氧化物，誘發(fā)大鼠腦組織的氧化應激狀態(tài)，使黑質致密部羥自由基形成增加、紋狀體脂質過氧化水平增高，產生潛在腦細胞毒性[10-14]。本實驗結果顯示，與空門組比較，胡桃醌各劑量組大鼠血清中L-Dopa及L-Trp含量明顯增加，中、高劑量組的變化尤為明顯，結合腦組織病理學觀察結果，提示胡桃醌可能通過影響Trp-Dopa代謝過程而造成潛在腦毒性。

L-Trp是機體必需氨基酸之一，血液中游離Trp通過血腦屏障進入大腦，在中樞神經系統(tǒng)中經色氨酸羥化酶作用轉化成5-羥色胺（5-HT），后者是與行為、情緒、睡眠及認知等諸多腦生理活動密切相關[15-17]。本研究結果顯示，與空門組比較，胡桃醌各劑量組大鼠血清中L-Trp含量均顯著降低，且成劑量依賴趨勢，提示胡桃醌可干擾正常大鼠機體Trp代謝。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌對大鼠的行為學、腦指數、腦組織形態(tài)均有明顯影響，推測其可能通過升高大鼠血清中L-Dopa、L-Tyr含量，降低L-Trp的含量影響腦組織功能，可為胡桃醌的臨床用藥提供安全性評價基礎。

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（收稿日期：2019-08-05修回日期：2019-10-12）

（編輯：唐曉蓮）