封義玲 羅曉健 賴衍清 蔡大宇 饒小勇 徐春良

中圖分類號 R95

文獻標志碼A

文章編號 1001-0408（2020）03-0303-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.10

摘要 目的：建立在線快速檢測華蓋散提取液濃縮過程中相關(guān)指標的方法，為其判斷濃縮終點提供參考。方法：采用近紅外光譜（ NIRS）在線采集裝置采集華蓋散提取液濃縮過程中73個濃縮液樣品的在線光譜圖，采用偏最小二乘法（PLS）建立NIRS與5個指標（濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量）間的定量校正模型，并用另外15個濃縮液樣品模型進行驗證，分析預(yù)測值與測量值之間的相關(guān)性。結(jié)果：所建立的定量校正模型中濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9825、0.9999、0.9983、0.9994、0.9993，校正集均方根誤差（RMSEC）分別為0.0016、0.0251、0.0147、0.0018、0.0009，交叉驗證均方根誤差（RMSECV）分別為0.002l、0.0358、0.0336、0.0063、0.0013。15個樣品驗證后，預(yù)測均方根誤差（RMSEP）分別為0.0032、0.0246、0.0215、0.0077、0.0059。結(jié)論：本研究所建立的定量校正模型預(yù)測性良好，可為華蓋散提取液濃縮終點的在線判斷提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 華蓋散;濃縮過程;近紅外光譜法;在線采集

濃縮是中藥制劑生產(chǎn)過程中的重要工序之一，常規(guī)的濃縮終點判斷多以經(jīng)驗為主，或采用相對密度作為終點判斷的指標，但該方法無法反映濃縮過程中藥效成分的變化和濃縮液質(zhì)量的一致性，將直接影響后續(xù)制劑的質(zhì)量[1]。因此中藥濃縮過程中含固量和指標成分含量等的在線檢測技術(shù)研究，對提高中藥濃縮液質(zhì)量具有重要意義。

美國FDA頒布的《PAT工業(yè)指南》提出PAT（過程分析技術(shù)）可以通過對過程的關(guān)鍵質(zhì)量屬性實時監(jiān)控，從而確保最終產(chǎn)品質(zhì)量[2]。近紅外光譜（NIRS）法作為PAT的最常用技術(shù)，具有綠色、無損、快速等優(yōu)點[3]。本課題組前期組裝了NIRS在線采集裝置，在實驗室中進行濃縮過程的在線檢測技術(shù)研究，模擬工業(yè)化生產(chǎn)過程，可為中藥濃縮生產(chǎn)過程的在線檢測提供參考。

華蓋散出自《太平惠民和劑局方》[4]，記載曰：“治肺感寒邪，咳嗽上氣，胸膈煩滿，項背拘急，聲重鼻塞，頭昏目眩，痰氣不利，呀呷有聲”，該方由紫蘇子（炒）、赤茯苓（去皮）、桑白皮（炙）、陳皮（去門）、杏仁（去皮、尖，炒）、麻黃（去根、節(jié)）、甘草（炙）等7味藥材組成，主治風(fēng)寒哮喘，現(xiàn)代臨床上多用于治療小兒咳嗽變異型哮喘[6]。該方為煮散劑，需患者自行煎煮，本課題組擬將該方制成顆粒劑，克服煎煮不便的問題。經(jīng)過前期研究，確定了華蓋散各組方飲片提取的工藝參數(shù)，現(xiàn)將NIRS法應(yīng)用于華蓋散提取液濃縮過程中，以濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量作為在線檢測的指標，建立NIRS與上述指標的定量校正模型，并實時檢測華蓋散濃縮過程中各指標的變化，以期為NIRS法在華蓋散提取液濃縮過程中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)，并為中藥濃縮過程中的終點判斷、產(chǎn)品中間質(zhì)量控制以及在線檢測等提供有效、可靠的途徑。

l 材料

1.1 儀器

E2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）;MS105型電子分析天平（瑞上梅特勒一托利多儀器有限公司）;YZN50型液體濃縮真空煎藥機（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司）;QWWJ-200型全無油靜音空壓機（上海曲晨機電技術(shù)有限公司）;QBY-15型氣動隔膜泵（溫州同創(chuàng)機械科技有限公司）;DA 7440 GP型近紅外分析儀（瑞上Perten公司）。

1.2 藥品與試劑

麻黃、苦杏仁、紫蘇子、陳皮（去門）、桑門皮、赤茯苓、甘草等7味藥材均購自江西江中飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉勇教授鑒定為真品;鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201508，純度：99.8%）、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號：171237-201510，純度：99.8%）、苦杏仁苷對照品（批號：110820-201607，純度：90.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 華蓋散濃縮液樣品的制備與收集

稱取麻黃、苦杏仁、紫蘇子、桑門皮、赤茯苓、陳皮（去白）各0.5kg，甘草0.25kg，共3.25kg藥材，加10倍量水（L/kg）于液體濃縮真空煎藥機中提取，提取2次，每次90min，過濾，合并濾液;濾液于60℃、-0.06MPa條件下濃縮，濃縮過程中采集NIRS（NIRS在線采集裝置由液體濃縮真空煎藥機、氣動隔膜泵、石英液體池、NIRS分析儀以及數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成，詳見圖1）。溶液經(jīng)氣動隔膜泵輸送至石英液體池中后循環(huán)回濃縮罐中，由NIRS分析儀采集數(shù)據(jù)，并連接NIRS工作站進行光信號的傳遞。保持溶液循環(huán)以采集實時光譜，在光譜采集過程中，關(guān)閉閥門b、c，打開閥門a，采集靜態(tài)藥液光譜，隨后由可拆卸軟管收集樣本。每次濃縮過程約7h，前4h約每30min取樣，后3h約每20min取樣，每份30mL。共濃縮5次，收集88個樣品（由于真空度或者升溫速率的不同，每次的濃縮時間不完全相同，因此所得樣品共88個）。取其中73個樣品（編號：S1～S73）用于定量校正模型的建立;取另外15個樣品用于模型的驗證。NIRS在線采集裝置圖見圖1。

2.2 華蓋散濃縮液樣品的NIRS在線模型圖譜的建立

NIRS采集測量方式為透反射，光程為4mm，分辨率為5nm，光譜采集范圍為950～1650nm，掃描速度為30次/秒，掃描時間為8秒，室內(nèi)溫度為（25±1）℃。取“2.1”項下收集的73個樣品（編號：S1～S73），按上述條件進行掃描分析，并采集NIRS。華蓋散濃縮液各樣品的NIRS疊加圖見圖2。

2.3 濃縮液密度的測定

在25℃的環(huán)境下，用移液管分別精密移取73個華蓋散濃縮液樣品各5mL（V），精密稱定其質(zhì)量（m）。每份樣品平行測定3次，計算濃縮液密度（p，p=m/V）。結(jié)果，73個華蓋散濃縮液樣品的密度范圍為1.01～1.09g/cm3。

2.4 含固量的測定

取73個量瓶置于105℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，分別精密稱定質(zhì)量（m¹）;精密移取73個華蓋散濃縮液樣品各5mL分別至上述量瓶中，精密稱定質(zhì)量（m²）;放入105℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，精密稱定質(zhì)量（m³）。每份樣品平行測量3次，計算含固量[含固量=（m³-m¹）/（m²-m¹）Xl00%]。結(jié)果，73個華蓋散濃縮液樣品的含固量范圍為0.79%～16.08%。

2.5 苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量測定

2.5.1 供試品溶液的制備取華蓋散濃縮液樣品（樣品編號：Sl）適量，用水稀釋至適當濃度，微孔濾膜濾過后，即得供試品溶液。

2.5.2 陰性樣品溶液的制備按照華蓋散處方，分別制備缺苦杏仁和麻黃藥材的陰性樣品溶液。

2.5.3 對照品溶液的制備精密稱取苦杏仁苷對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為36.95μg/mL的苦杏仁苷對照品溶液，備用;精密稱取鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為49.70、50.01μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.5.4 色譜條件 （1）苦杏仁苷含量測定的色譜條件。色譜柱為PhenomenexSynergiTM Polar-RP 80A（250mmx4.6mm.4μm）;流動相為乙腈-水（6：94，V/V）;流速為1mL/min;檢測波長為207nm;柱溫為30℃;進樣量為10μL。（2）鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量測定的色譜條件。參考2015年版《中國藥典》（二部）中相關(guān)方法[6]，色譜柱為Phenomenex SynergiTM Polar-RP 80A（250 mmx4.6mm，4μm）;流動相為甲醇-水（含0.092%磷酸、0.04%三乙胺、0.02%二正丁胺）（1.5：98.5，V/V;流速為1mL/min;檢測波長為210nm;柱溫為30℃;進樣量為10μL。

2.5.5 專屬性考察分別吸取“2.5.1”～“2.5.3”項下供試品溶液、陰性樣品溶液、各對照品溶液各10μL，按“2.5.4（1）（2）”項下色譜條件分別進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液中各組分在上述色譜條件下均分離良好，各陰性樣品對苦杏，苷、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的測定均無干擾，表明該方法專屬性良好。高效液相色譜圖見圖3。

2.5.6 線性關(guān)系考察分別以甲醇為溶劑制備含苦杏仁苷230.945、115.472、57.736、28.868、14.434，7.217μg/mL，鹽酸麻黃堿248.50、124.25、62.13、31.06、15.53、7.77μg/mL，鹽酸偽麻黃堿250.50、125.25、62.62、31.31、15.66、7.83μg/mL的系列質(zhì)量濃度標準工作溶液。分別吸取上述溶液10μL，分別按“2.5.4（1）（2）”項下色譜條件進樣分析。以苦杏，苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到回歸方程。結(jié)果，苦杏仁苷的回歸方程為y=10338x-31 097（r=0.9998），鹽酸麻黃堿的回歸方程為y=22 197x-37233（r=0.9999），鹽酸偽麻黃堿的回歸方程為y=22992x-52488（r=0.9999），三者分別在7.217～230.945、7.77～248.50、7.83～230.50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.7 精密度試驗取“2.5.3”項下對照品溶液各適量，分別按“2.5.4（1）（2）”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏，苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.64%、0.12%、0.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗取華蓋散濃縮液樣品（樣品編號：Sl），按照“2.5.1”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置O、2、4、8、12、24h后，分別按“2.5.4（1）（2）”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為1.34%、1.09%、0.21%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.9 重復(fù)性試驗取華蓋散濃縮液樣品（樣品編號：Sl），按“2.5.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.5.4（1）（2）”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.93%、1.89%、1.37%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.10 含量測定 取73個華蓋散濃縮液樣品適量，按“2.5.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.4（1）（2）”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量。結(jié)果，苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量范圍分別為0.1293～2.4053、0.0255～0.5137、0.0107～0.2407mg/mL。

2.6 數(shù)據(jù)處理、建模及模型驗證

將采集的73個樣品的NIRS與其所對應(yīng)的濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量導(dǎo)入The Unscrambler 9.7軟件（網(wǎng)址：https：//www.ca-mo.com/），選擇合適的建模波段和光譜預(yù)處理方法，運用偏最小二乘（PLS）法計算[7]，采用交叉驗證法，建立NIRS與各指標間的定量校正模型。

2.6.1 建模波段的選擇華蓋散濃縮液樣品的光譜采集范圍為950～1650nm。由于其溶劑是水，而純水的NIRS在1440nm波長附近吸收峰較強，波譜較寬[8]，對樣品吸收峰的干擾較大，且通常認為吸收度大于1.5的波長區(qū)間為飽和吸收，故建模時不宜采用這一波段的光譜[9]。因此，排除水的強吸收波段后，確定950～1375nm與1505～1650nm為建模波段。

2.6.2 NIRS定量校正模型相關(guān)參數(shù)的選擇 NIRS定量校正模型以相關(guān)系數(shù)（R2）、校正均方根誤差（RMSEC）、交叉驗證均方根誤差（RMSECV）和預(yù)測均方根誤差（RMSEP）為指標優(yōu)化建模參數(shù)。其中，R₂越接近于1，說明模型的預(yù)測值與測量值的相關(guān)性越好;RMSEC和RMSECV越小且越接近，說明該模型穩(wěn)定性越好，精確度越高;RMSEP越小，說明模型的預(yù)測效果越好[10]。

2.6.3 NIRS定量校正模型預(yù)處理方法的選擇 在近紅外透反射光譜的采集過程中，背景噪聲和特定物理因素等會對NIRS產(chǎn)生影響，可能會造成光譜基線的偏移和噪音信號的放大[11]。因此在進行光譜分析之前，應(yīng)對采集的原始光譜進行必要的預(yù)處理。本文選擇了近紅外光譜中常見的5種預(yù)處理方法[一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay平滑濾波、二階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay平滑濾波、標準變量變換（SNV）、一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay平滑濾波+SNV、附加散射校正（MSC）]，比較了無預(yù)處理方法以及5種預(yù)處理方法對R2、RMSEC和RMSECV的影響，詳見表1。

由表1可得，濃縮液密度可選用一階導(dǎo)數(shù)+Savitz-ky-Golay平滑濾波進行預(yù)處理;含固量可選用一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay平滑濾波+SNV進行預(yù)處理;苦杏仁苷和鹽酸偽麻黃堿含量不進行光譜預(yù)處理;鹽酸麻黃堿含量選用MSC進行預(yù)處理。

2.6.4 主因子數(shù)的確定 在采用PLS建模的過程中，主因子數(shù)過少會導(dǎo)致信息不全，過多容易造成模型的過擬合，因此選擇適合的主因子數(shù)有利于提高模型的預(yù)測性[12]。RMSECV越小，模型的精確度越高，其對應(yīng)的主因子數(shù)即為最優(yōu)主因子數(shù)[10]。主因子數(shù)與RMSECV的關(guān)系圖見圖4。

由圖4可知，濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的最優(yōu)主因子數(shù)分別為8、8、10、9、8。

2.6.5 NIRS定量校正模型的建立將所有光譜和各組數(shù)據(jù)導(dǎo)入The Unscrambler 9.7軟件后，經(jīng)過上述確定的光譜預(yù)處理方法處理后，運用PLS和交叉驗證法建立NIRS定量校正模型，并評價NIRS定量校正模型各指標的預(yù)測值與測量值的相關(guān)性，確定所建立的NIRS定量校正模型是否合理。結(jié)果，建立的NIRS定量校正模型中濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量等5種指標的R₂分別為0.9825、0.9999、0.9983、0.9994、0.9993，RMSEC分別為0.0016、0.0251、0.0147、0.0018、0.0009，RMSECV分別為0.0021、0.0358、0.0336、0.0063、0.0013;NIRS定量校正模型的預(yù)測值與測量值間的相關(guān)性良好，表明所建立的NIRS定量校正模型合理，詳見圖5。

2.6.6 NIRS定量校正模型的驗證采集“2.1”項下用于驗證試驗的15個樣品的NIRS，并將上述建立的NIRS定量校正模型導(dǎo)入The Unscrambler 9.7軟件中，分析濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的預(yù)測值與測量值的相關(guān)性。結(jié)果，驗證試驗中濃縮液密度、含固量和苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的R₂分別為0.9237、0.9898、0.9959、0.9867、0.9611，RMSEP分別為0.0032、0.0246、0.0215、0.0077、0.0059;各指標預(yù)測值與測量值的相關(guān)性良好，詳見圖6。

3 討論

華蓋散方中麻黃和苦杏仁是君藥與臣藥，麻黃宣肺化痰、解表發(fā)汗為君，苦杏仁降氣消痰、宣肺止咳為臣[13]。因而，麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁中的苦杏仁苷含量是工藝監(jiān)測的重要指標。華蓋散濃縮液密度與含固量則與制劑成型工藝息息相關(guān)。因此，本試驗以鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿及苦杏仁苷含量為化學(xué)指標，以濃縮液密度、含固量為物理指標，構(gòu)建了一個多指標體系，為華蓋散提取液濃縮過程的質(zhì)量監(jiān)控提供依據(jù)。

試驗中選用石英液體池配合NIRS探頭采集華蓋散濃縮液的在線圖譜。華蓋散提取液不斷循環(huán)，以保證采集其實時NIRS;同時，將石英液體池置于提取液循環(huán)的旁路，可采集靜態(tài)提取液光譜，避免濃縮過程中產(chǎn)生氣泡，干擾NIRS的采集。液體池選用石英玻璃，可減少由于器皿的吸光度對光譜采集準確性的影響;選用氣動隔膜泵是因為其具有較強的自吸能力，可將溶液由濃縮罐中吸出1，使提取液循環(huán)，便于采集實時光譜。

本研究將NIRS法用于華蓋散提取液的濃縮過程，建立了華蓋散濃縮液中多指標同時在線測定的方法，解決了離線分析周期長的問題。該方法無需樣品處理，操作簡便、快速，可在線測定，后續(xù)可在實際生產(chǎn)中對所建立的模型進行完善和再校正，進一步提高模型在華蓋散提取液濃縮過程的適用性與穩(wěn)定性。

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（收稿日期：2019-08-11修回日期：2019-10-17）

（編輯：唐曉蓮）