馮嬋婧, 孫廣正, 王陽, 馬青

番茄抗白粉病功能分析

馮嬋婧, 孫廣正, 王陽, 馬青

（西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

【】白粉?。╬owdery mildew）是番茄生產(chǎn)上的重要病害，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量。番茄基因組測序工作的完成為抗病基因挖掘提供了重要的信息資源。ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）復(fù)合體是肌動蛋白微絲骨架動力學(xué)的主要調(diào)控因子，能夠參與包括響應(yīng)外界脅迫等多種細(xì)胞學(xué)過程。本研究通過對番茄（actin-related protein C5）進(jìn)行克隆和抗病功能驗(yàn)證，為番茄基因組信息完善、抗病機(jī)制解析和分子育種等方面打下基礎(chǔ)。從番茄LA1777（）cDNA中PCR擴(kuò)增，使用DNAMAN 6.0進(jìn)行多序列比對；MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；應(yīng)用在線工具ProtComp v. 9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）比較接種白粉菌（，-Lz）后高感品種Moneymaker（MM）和高抗品種LA1777中番茄的表達(dá)特征，分析白粉菌侵染與表達(dá)的相關(guān)性。應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在番茄中的抗病功能，觀察沉默株和野生型株系接種后表型變化，利用臺盼藍(lán)和DAB染色法檢測植株產(chǎn)生過敏性壞死和H2O2的能力，并檢測沉默后一些與植物抗病相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)變化。采用農(nóng)桿菌浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥過表達(dá)植株，觀察轉(zhuǎn)基因和野生型株系接種后表型變化，并統(tǒng)計單病斑分生孢子數(shù)。從番茄品種LA1777中克隆到，編碼132個氨基酸殘基，包含一個保守的P16-Arc結(jié)構(gòu)域。與番茄MM-白粉菌親和互作相比，非親和互作的番茄品種LA1777在接種白粉菌后，顯著上調(diào)表達(dá)，尤其在接種后18 h。在番茄上沉默能夠增加植株對白粉菌-Lz的敏感性，防衛(wèi)反應(yīng)基因顯著下調(diào)表達(dá)。組織學(xué)觀察顯示與對照植株相比，沉默植株接種后誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏性壞死和活性氧減少。在煙草上瞬時過表達(dá)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生壞死斑。相反，在擬南芥上過表達(dá)能夠增加植物的抗病性。是番茄響應(yīng)白粉菌侵染的重要基因，可減輕番茄白粉病的發(fā)病程度，在番茄抗白粉病機(jī)理研究方面具有較大的應(yīng)用價值，可作為番茄抗白粉病分子育種的一個候選基因。

番茄白粉?。豢共⌒?；肌動蛋白微絲骨架；ARP2/3復(fù)合體；ARPC5

0 引言

【研究意義】番茄白粉菌（）是一種活體營養(yǎng)寄生菌，能在番茄葉表面、背面、葉柄和花萼上產(chǎn)生白粉病斑，但不侵染果實(shí)。它通過影響植物的葉片使葉片失去生長活力，能導(dǎo)致產(chǎn)量（果實(shí)）損失高達(dá)50%[1]。目前，在溫室和大田中對番茄白粉病的控制主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)藥劑不僅增加病原菌抗藥性，也通過果實(shí)中農(nóng)藥的殘留對環(huán)境和人體造成危害[2]。大多數(shù)栽培番茄易受白粉菌侵染，控制番茄白粉病的有效策略是培育抗性品種。【前人研究進(jìn)展】目前，野生番茄品種中一些抗性基因已經(jīng)被鑒定并轉(zhuǎn)入栽培番茄，包括5個顯性基因（、、、、）、1個隱性基因（）和3個多基因抗性數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTLs）[3]。研究發(fā)現(xiàn)抗性基因介導(dǎo)的對番茄白粉病的抗病性與過敏性壞死（hypersensitive response，HR）有關(guān)[3]。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生HR時，未受感染的鄰近細(xì)胞顯示肌動蛋白微絲（actin filaments，AFs）聚集現(xiàn)象[4]。AFs是形成肌動蛋白細(xì)胞骨架的主要結(jié)構(gòu)元件，既能將質(zhì)膜和細(xì)胞壁上的物質(zhì)通過囊泡的靶向輸送轉(zhuǎn)運(yùn)到生長位點(diǎn)，也能特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)防衛(wèi)相關(guān)物質(zhì)形成抵御病原菌侵入的屏障[5-6]。肌動蛋白組成的關(guān)鍵步驟是肌動蛋白成核，而肌動蛋白成核在很大程度上受ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）復(fù)合體的活性調(diào)節(jié)，這能確保AFs正確形成[7]。ARP2/3復(fù)合體包含7個亞基，分別為ARP2、ARP3、ARPC1-ARPC5。該復(fù)合體是一種高度保守的肌動蛋白調(diào)節(jié)劑，能核化與質(zhì)膜區(qū)域相關(guān)的分支狀的肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)，也能促進(jìn)特定細(xì)胞器和細(xì)胞骨架的耦合、在核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)間提供某種形式的物理連續(xù)性[8]。ARP2/3復(fù)合體不同亞基在發(fā)育過程中起著不同的作用。例如，ARP2對膜結(jié)合是必不可少的[9]；ARP3在體內(nèi)定位于肌動蛋白成核部位[10]；ARPC1或ARPC2的缺失導(dǎo)致釀酒酵母的致死性和生存能力嚴(yán)重下降；擬南芥（）ARP3或ARPC5的功能喪失導(dǎo)致根毛短小且彎曲[11-12]；ARPC4是控制ARP2/3復(fù)合體組裝和穩(wěn)定性的最關(guān)鍵亞基[9]；ARPC4和ARPC5在介導(dǎo)與ABA-和H2O2-誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞肌動蛋白動力學(xué)中起關(guān)鍵作用[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ARP2/3復(fù)合體的亞基除了能夠參與植物生長發(fā)育和結(jié)構(gòu)組成，較少的研究證實(shí)其參與植物的抗病性[14]。西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害綜合治理團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)白粉菌（-Lz）與番茄Moneymaker（MM）（）形成親和互作，而與番茄LA1777（）非親和互作，在非親和互作體系中番茄受白粉菌誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，推測其可能參與抗白粉菌侵染的過程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析、差異性誘導(dǎo)表達(dá)、VIGS分析、煙草瞬時表達(dá)、擬南芥過量表達(dá)以及酵母突變體異源互補(bǔ)等方面的研究，為進(jìn)一步揭示其抗病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2018年在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

番茄白粉菌菌株-Lz采自甘肅省蘭州市，分離保存在栽培番茄（Moneymaker，MM）上，生長溫度（20±3）℃，相對濕度（70±5）%，16 h光照/8 h黑暗。

番茄MM和-Lz構(gòu)成親和互作體系，LA1777和-Lz構(gòu)成非親和互作體系。番茄種子消毒后，在25℃、95%相對濕度和3 500 lx光照下生長[15]。生態(tài)型擬南芥Columbia-0（Col-0）購自擬南芥生物資源中心（Ohio）。按照WU等[16]的方法對擬南芥種子進(jìn)行消毒和催芽。發(fā)芽和生長分別在21℃和19℃生長室，8 h光照/16 h黑暗，相對濕度為70%。

1.2 生物信息學(xué)分析

以擬南芥ARPC5（序列號：NP_567216.1）氨基酸序列作為指示查詢序列在SGN Tomato Combined數(shù)據(jù)庫（http://solgenomics.net/tools/blast/）TBLASTN程序、GenBank的BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/blast.cgi）程序搜索同源序列。利用NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）的BLAST程序和基因開放式閱讀框（ORF）分析的cDNA序列。使用DNAMAN6.0進(jìn)行多序列比對。用Mega 6.0軟件的鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用RCSB PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb. org/）。利用Protcomp程序（v.9.0，http://linux1.softberry. com/berry.phtml）預(yù)測ARPC5蛋白亞細(xì)胞定位。

1.3 煙草瞬時過表達(dá)

利用ARPC5-TF（5′-ATGGCTGAGATTGTCGAAGCAGATA-3′，下劃線為載體同源臂）和ARPC5-TR（5′-TCACACAGTATTCACAGTGTCAGCA-3′，下劃線為載體同源臂）擴(kuò)增的ORF，將擴(kuò)增產(chǎn)物同源重組到PGR106載體的I酶切位點(diǎn)，由CaMV35S啟動子驅(qū)動。參照LU等[17]的方法將重組質(zhì)粒pGR106:或pGR106:（陰性對照）電轉(zhuǎn)至根癌農(nóng)桿菌GV3101中，將轉(zhuǎn)化子處理后在黑暗中培養(yǎng)2—3 h，然后注射到煙草葉片，接種后5—7 d對表型進(jìn)行觀察。

1.4 病毒誘導(dǎo)基因沉默

利用ARPC5-VF（5′-CGAAGGCATAATCACAAGAATCG-3′，下劃線為載體同源臂）和ARPC5-VR（5′-CAGCAAGACAACGCAGTATGCA-3′，下劃線為載體同源臂）擴(kuò)增基因片段，重組TRV2:質(zhì)粒。參照LIU等[18]的方法，將TRV1和TRV2:農(nóng)桿菌混合菌液注射到番茄LA1777植株葉片。TRV2:（序列登錄號：NM 001247166）作為陽性對照。接種病毒30 d，觀察沉默植株的光漂白癥狀。在葉片上接種-Lz 7 dpi（days post inoculation）觀察葉片侵染表型。參照SUN等[19]的方法在7—14 dpi統(tǒng)計病害嚴(yán)重度，計算病情指數(shù)（DI），病情指數(shù)（DI）＝[Σ（某一病害嚴(yán)重度的發(fā)病植物葉片數(shù)×病害嚴(yán)重度）/（調(diào)查總植株葉片數(shù)×最高病級）]×100。利用THORDAL- CHRISTENSEN等[20]的方法對植物葉片進(jìn)行3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和臺盼藍(lán)染色，分別于6、18、24、48、72 hpi（hours post inoculation）在分生孢子侵染點(diǎn)處檢測植物產(chǎn)生HR和H2O2的形成率，形成率=（HR或H2O2在侵染點(diǎn)處形成個數(shù)/總侵染點(diǎn)數(shù)）×100%。

1.5 擬南芥過量表達(dá)

利用ARPC5-AF（5′-ATGGCTGAGATTGTCGAAGCA-3′，下劃線為載體同源臂）和ARPC5-AR（5′-TCACACAGTATTCACAGTGTCAGCA-3′，下劃線為載體同源臂）擴(kuò)增的ORF區(qū)段，重組到雙元載體pCAMBIA3301的HI限制酶（Promega）位點(diǎn)，由CaMV35S啟動子驅(qū)動。將pCAMBIA3301-轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101，然后通過浸花法將其導(dǎo)入Col-0野生型擬南芥中[21]。轉(zhuǎn)基因T1代植株用含卡那霉素（25 μg·mL-1）的0.5×MS培養(yǎng)基/1%瓊脂進(jìn)行陽性篩選。催芽2周后，將抗卡那霉素幼苗移栽到土壤中。從自交的T1株系中獲得卡那霉素抗性的T2代植株，T2代植株生長90 d（每個處理3—4株），然后測定轉(zhuǎn)基因株系對-Lz的抗性。同時，上述T2代植株通過使用特異性引物（LP-CGGTT CTCCAAATGAAGACTT，RP-AATTGAGACTTTTC AAAGGTAATA）PCR檢測確認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植株。為了量化病原菌生長狀況，在7 dpi統(tǒng)計每個病斑的分生孢子數(shù)。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

為了評估在番茄MM和LA1777上接種病菌后表達(dá)量的變化，在0、12、18、24、36、48、72和96 hpi采樣，提取RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，然后進(jìn)行qRT-PCR。VIGS試驗(yàn)中，在0、24、48和72 hpi檢測沉默效率以及（）和（）、（）表達(dá)量，作為內(nèi)參基因。擬南芥轉(zhuǎn)基因植物在0、24、48、72 hpi取樣進(jìn)行qRT-PCR，以為內(nèi)參基因（表1）。

使用Biozol總RNA提取試劑盒提取總RNA，Qubit 2.0 Fluorometer計算RNA濃度。使用單鏈cDNA合成試劑盒和oligo (dT)18引物將總RNA（1 μg）用于第一鏈cDNA合成。采用IQTM5 real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在qRT-PCR反應(yīng)中，將2 μL總cDNA添加到含有10 μL 2×SYBR混合液的20 μL PCR反應(yīng)液中，上下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），dH2O 7.2 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：在95℃預(yù)變性10 min，隨后在95℃變性15 s，40個周期，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。定量結(jié)果通過2-??CT法計算。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR反應(yīng)中的基因及引物

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，＜0.05表示兩組處理間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 番茄ARPC5鑒定和序列分析

利用擬南芥作為探索基因，從番茄LA1777中克隆到767個核苷酸的基因片段。（Solyc01g090450.3）的開放閱讀框（399 bp）編碼132個氨基酸，分子量約為15 kD。ARPC5與ARPC5和ARPC5具有高度的序列相似性（圖1），其同源性分別為86.36%和97.73%。SMART和RCSB PDB程序分析顯示，ARPC5具有保守的Pfam:P16-Arc結(jié)構(gòu)域（氨基酸2—131），其遺傳關(guān)系與ARPC5和ARPC5密切相關(guān)。ProtComp 9.0程序預(yù)測ARPC5蛋白具有不同的細(xì)胞定位，包括質(zhì)膜、胞外、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、高爾基體和葉綠體。

2.2 ARPC5差異性誘導(dǎo)表達(dá)

為了確定的表達(dá)量，用qRT-PCR檢測番茄與病原菌互作時的mRNA表達(dá)量。在非親和互作中，與0 hpi相比，在18—36 hpi顯著上調(diào)表達(dá)（＜0.05），在18 hpi的表達(dá)量達(dá)到峰值（圖2），為對照的6倍。此外，在親和互作中，表達(dá)量在18 hpi顯著高于對照（0 hpi），12 hpi以及36—96 hpi表達(dá)量顯著低于對照（＜0.05）。

2.3 沉默ShARPC5對番茄抗病性的影響

為了確定在病原菌侵染番茄中的作用，利用煙草脆裂病毒（，TRV）誘導(dǎo)沉默驗(yàn)證基因功能。接種TRV2:的葉片在接種后30 d出現(xiàn)光漂白的表型（圖3-A），證實(shí)TRV-VIGS沉默系統(tǒng)的穩(wěn)定性。與對照相比，沉默植株顯示出明顯的白粉病病斑，沉默株的病情指數(shù)更高，在7和14 dpi分別達(dá)到6.0和13.1（圖3-B）。在24 hpi的沉默效率達(dá)到78%（圖3-C），且沉默株中顯著下調(diào)表達(dá)（＜0.05）。

A：ShARPC5的多重氨基酸序列比對以及氨基酸序列的特征。氨基酸序列中黑色部分表示同源性達(dá)到100%，粉色表示同源性≥75%，青色表示同源性≥50% Multiple protein sequence alignment of ShARPC5 and characterized members of ARPC5 proteins. Black boxes indicate regions of 100% homology, pink boxes indicate ≥75% homology level, and cyan boxes highlight ≥50% homology level；B：ShARPC5系統(tǒng)進(jìn)化分析，在不同的基因名稱后顯示各基因登錄號Evolutionary analysis of ShARPC5. Accession numbers are shown after the gene names

圖2 qRT-PCR分析番茄葉片ARPC5表達(dá)量

A：不同處理（對照株、沉默ShPDS植株、沉默ShARPC5植株）接種白粉菌7 d后的表型觀察Infection phenotypes of CK (TRV2), TRV2:ShPDS, TRV2:ShARPC5 tomato leaves at 7 dpi；B：對照株和沉默ShARPC5植株在接種白粉菌后7和14 d的病情指數(shù)Disease indexes of CK and TRV2:ShARPC5 plants at 7 and 14 dpi, respectively；C：對照株和沉默株接種白粉菌后24 h ShARPC5和PRs基因表達(dá)量變化Relative mRNA transcript levels of ShARPC5 and PRs at 24 hpi (determined by qRT-PCR)

2.4 沉默ShARPC5對番茄防衛(wèi)反應(yīng)的影響

通過顯微觀察病原菌侵染番茄葉片后植物上產(chǎn)生的HR和H2O2變化進(jìn)一步研究如何參與番茄抗病性。在48和72 hpi，沉默的植株上HR形成率顯著低于對照，分別為26%和36%（圖4-A）；在72 hpi，沉默株上的H2O2形成率顯著低于對照（＜0.05），僅為34%（圖4-B）。

2.5 煙草瞬時表達(dá)ShARPC5分析

為了進(jìn)一步檢測的功能，基于PVX瞬時植物表達(dá)系統(tǒng)，使用本氏煙（）評估是否誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死。用表達(dá)PGR106:的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片不能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞壞死，但是用轉(zhuǎn)PGR106:的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片產(chǎn)生明顯的細(xì)胞壞死（圖5）。同樣，用表達(dá)PGR106:的農(nóng)桿菌侵染葉片也能產(chǎn)生壞死。

2.6 過表達(dá)ShARPC5對擬南芥抗病性的影響

為了檢測ARPC5在擬南芥上的抗病性，分別在野生型Col-0擬南芥和野生型Col-0轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-植株上接種-Lz。過表達(dá)（over-expression，OE）擬南芥植株抗病性增強(qiáng)，植株葉片上幾乎未發(fā)現(xiàn)白粉病病斑（圖6-A）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在野生型Col-0轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-植株上單個病斑分生孢子數(shù)顯著減少（圖6-B，＜0.05）。

3 討論

通過核苷酸和氨基酸序列比對，表明番茄ARPC5與擬南芥和煙草ARPC5具有高度相似性，這些蛋白具有類似的保守的P16-ARC結(jié)構(gòu)域，推測ARPC5在這3個物種上行使相似的功能，包括對生物和非生物脅迫的響應(yīng)。作為植物的防御信號，本研究結(jié)果證明了番茄在遭受白粉菌侵染時所起的作用。

A：對照植株和沉默植株接種白粉菌后24、48和72 h壞死產(chǎn)生率HR production rate of TRV2 (CK) or TRV2:ShARPC5 tomato leaves at 24, 48, and 72 hpi, respectively；B：對照植株和沉默植株接種白粉菌后24、48和72 h H2O2產(chǎn)生率H2O2 production rate of CK or TRV2:ShARPC5 tomato leaves at 24, 48, and 72 hpi, respectively

A：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)在接種7 d后葉片的表型Leaf phenotypes at 7 dpi with Agrobacterium tumefaciens-expressing constructs；B：A中的煙草葉片用1﹕1的乙醇和冰醋酸脫色后的表型Leaf inoculation phenotypes after clearing in ethanol/acetic acid (1﹕1, v/v) for 2 days

A：野生型Col-0轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-ShARPC5植株上接種On-Lz 7 d后表型觀察Infection phenotypes of WT Col-0 transgenic plants expressing pCAMBIA3301-ShARPC5. Images were taken at 7 dpi；B：野生型Col-0轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-ShARPC5植株上接種On-Lz 7 d后植株上單病斑分生孢子數(shù)Quantitative assessment of conidiation on WT Col-0 plants expressing pCAMBIA3301-ShARPC5. Images were takenat 7 dpi

為了確定ARPC5是否參與植物與病原菌的互作過程，本研究檢測了番茄被白粉菌侵染后植物中表達(dá)量的變化。在病原菌侵染初期，非親和互作的番茄能快速上調(diào)表達(dá)，尤其在18 hpi，可能在早期的激活防御信號中，表達(dá)量的增加與病原菌初生吸器的大量形成有關(guān)。相反，在親和互作體系中，除了18—24 hpi，其余時間點(diǎn)的表達(dá)量較對照均顯著下調(diào)。因此，ARPC5可能是番茄抗病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

VIGS是一種廣泛使用的反向遺傳學(xué)技術(shù)，特點(diǎn)是使用簡單、快速和穩(wěn)定[22]。沉默后，沉默效率不能達(dá)到100%可能與農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率、病毒的感染效率、沉默片段的選擇以及該基因在植物發(fā)育中的多種功能有關(guān)[23]。沉默株更加感病說明ARPC5是ARP2/3復(fù)合體介導(dǎo)的番茄抗白粉病的關(guān)鍵亞基。研究表明該抗病性可能與ARP2/3復(fù)合體介導(dǎo)的肌動蛋白聚合有關(guān)，該復(fù)合體也在植物防御信號級聯(lián)反應(yīng)中起作用[24-25]。此外，擬南芥異源過表達(dá)時，轉(zhuǎn)基因植株比對照Col-0植株的抗病性更強(qiáng)，說明ARPC5蛋白功能具有保守性。并且沉默后，植物的長勢并不會受影響，因此該基因可以作為一個抗番茄白粉病育種的優(yōu)勢抗病基因。

植物細(xì)胞微絲骨架能在病原菌侵染初期作出快速識別和反應(yīng)。如ADF7能介導(dǎo)微絲骨架的動態(tài)變化，通過小麥積累ROS和產(chǎn)生HR抗條銹病[26]。本研究發(fā)現(xiàn)番茄LA1777植株接種白粉菌后能快速誘導(dǎo)產(chǎn)生HR和H2O2，而沉默株產(chǎn)生HR和H2O2遲緩，抗病能力減弱。事實(shí)上，微絲骨架的重排與激活植物防衛(wèi)信號有關(guān)，包括氧迸發(fā)和誘導(dǎo)細(xì)胞壞死、抗病基因的表達(dá)、侵染點(diǎn)處乳突的形成等[27]，推測ARP2/3復(fù)合體能通過調(diào)節(jié)HR和H2O2積累量發(fā)揮抗病作用。微絲骨架可以調(diào)節(jié)細(xì)胞器的移動[28]，而葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等細(xì)胞器是產(chǎn)生活性氧的主場所[29]，因此可能在ETI途徑中通過介導(dǎo)細(xì)胞器的移動積累活性氧。沉默后，沉默株上的表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá)，說明在白粉菌侵染植株的早期，植株能夠激活先天免疫反應(yīng)通過PTI途徑阻止病原菌的侵染。本研究闡明了在番茄響應(yīng)生物脅迫時作出的反應(yīng)，包括產(chǎn)生ROS和HR，以及誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白基因（）的表達(dá)。結(jié)合番茄的功能研究[14]，說明ARP2/3復(fù)合體在病原菌侵染過程中參與抗病作用。

4 結(jié)論

番茄ARPC5包含一個保守的P16-Arc結(jié)構(gòu)域。ARPC5可能通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏性壞死和活性氧以及調(diào)節(jié)防衛(wèi)基因的表達(dá)參與番茄抗白粉病，是一個潛在重要的抗病基因。

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Functional Analysis of GeneInvolved in Tomato Resistance to Powdery Mildew

FENG ChanJing, SUN GuangZheng, WANG Yang, MA Qing

(College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi)

【】Powdery mildew is an important disease in tomato production, and seriously affects the yield of tomato. Genome sequences ofprovide valuable information resources for disease-resistant gene searching. The actin- related protein 2 and 3 complex (ARP2/3 complex), a key regulator of actin cytoskeletal dynamics, has been linked to multiple cellular processes, including those associated with response to stress. In this study, tomato, encoding a subunit protein of the ARP2/3 complex, was cloned and identified for disease resistance. The results will lay a foundation for upgrading tomato genomic information, further studying the resistance mechanism and molecular breeding.【】was annotated from the genomic databases and cloned from tomato LA1777 (). DNAMAN 6.0 was used for multiple sequence alignment and MEGA 6.0 was used for constructing phylogenetic tree. The prediction of protein subcellular localization was performed using ProtComp v. 9.0. The qRT-PCR was used to compare the expression of(-Lz). The correlation between-Lz infection andexpression was analyzed. The function ofinvolving in tomato resistance to-Lz was further verified by the technology of virus-induced gene silencing (VIGS). The phenotypic changes of-silenced and wild-type lines were observed. Hypersensitive response (HR) and H2O2production were detected by trypan blue and DAB staining, respectively, and the expression of some marker genes related to plant disease resistance was assayed in-silenced plants. Additionally, genetic transformation ofwas conducted by-mediated floral-dip method. The phenotypic changes of transgenic and wild-type lines were observed, and the number of conidia per lesion was also counted.【】Thewas identified and characterized.encodes a 132-amino-acid protein possessing a conserved P16-Arc domain.Compared with the compatible interaction between tomato MM (Moneymaker) and-Lz, the expression ofwas significantly up-regulated in incompatible interaction between tomato LA1777 and-Lz, especially at 18 hpi. Silencing of-Lz. The expression of, a maker gene related to signal regulation, was significantly down-regulated after silencing of. The histological observation showed that the induction of hypersensitive cell death and the generation of reactive oxygen were reduced in silenced-tomato plants compared with wild types. Transient over-expression ofConversely, over-expression of, followed by inoculation with-Lz, showed enhanced resistance.【】is animportant gene which can reduce the incidence of tomato powdery mildew, and has a great application value in themechanism study of tomato resistance to powdery mildew. At the same time, it can be used as a candidate gene for molecular breedingof tomato powdery mildew resistance.

tomato powdery mildew; resistance; actin cytoskeleton; ARP2/3 complex; ARPC5

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.006

2019-07-10；

2019-08-21

國家自然科學(xué)基金（31571960）、陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈項(xiàng)目（2019ZDLNY03-07）、西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站（基地）科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2018-10）、高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃（B07049）

馮嬋婧，E-mail：fcj413@163.com。通信作者王陽，E-mail：wangyang2006@nwsuaf.edu.cn。通信作者馬青，E-mail：maqing@nwsuaf.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）