許斌, 朱雨婷, 侯麗真, 倪楠, 扎羅, 王鳳忠*, 李淑英*

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南京 210095；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 北京 100193；

3.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206；

4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所, 拉薩 850032

黃蘑菇，又名皇菇、黃環(huán)菌，學(xué)名為黃綠蜜環(huán)菌(Armillarialuteo-virens)，是高山草甸上的一種名貴的珍稀野生食用菌[1]。新鮮黃蘑菇味道鮮美、香氣濃郁、營養(yǎng)豐富，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)元素等，特別是微量元素硒的含量較高，具有補充營養(yǎng)、增進食欲、增強免疫力、抗流感、促進兒童發(fā)育以及防治神經(jīng)炎、腳氣病等生理作用[2-4]。黃蘑菇主要分布于我國河北、陜西、甘肅、青海、四川、西藏等地區(qū)[1-6]。在西藏主產(chǎn)于拉薩、堆龍德慶、達孜、浪卡子、帕里、邦達、定日等地的高山草地上，其海拔分布范圍為3 200～4 600 m[6]。

由于黃蘑菇味道鮮美、營養(yǎng)豐富，集食用、藥用和保健功能于一身，深受消費者的喜愛，市場需求量逐年增加。黃蘑菇子實體生長的季節(jié)性很強，集中在7月中旬至8月下旬雨季生長[6]，目前主要以鮮食和晾干為主，市場上新鮮黃蘑菇的價格為80～400元·kg-1，干品價格可達1 000元·kg-1[7]。然而，新鮮黃蘑菇在采后儲藏過程中極易發(fā)生失水、軟化和褐變等現(xiàn)象，嚴(yán)重降低其食用價值和商品價值。

為了盡量保持新鮮黃蘑菇的獨特鮮味，延長黃蘑菇的貨架期，拓展新鮮黃蘑菇的市場范圍，開展了黃蘑菇保鮮研究。本研究首先觀察了黃蘑菇在室溫儲藏過程中的感官變化，隨后選用酸性電解水(acidic electrolyzed water，AEW)、短波紫外線(short-wave ultraviolet，UVC)和臭氧(O3)等保鮮處理技術(shù)，并聯(lián)合低溫儲藏，對新鮮黃蘑菇進行保鮮研究，通過檢測褐變度、硬度和失重率來評價不同保鮮處理后黃蘑菇感官品質(zhì)的變化，通過檢測多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性變化來探索黃蘑菇在儲藏期的生理變化規(guī)律，以期為黃蘑菇的保鮮研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃蘑菇，購于西藏自治區(qū)昌都，黃蘑菇采后，直接打包冷鏈空運到實驗室開展保鮮處理。

聚乙烯吡絡(luò)烷酮、磷酸緩沖液、鄰苯二酚、硼酸緩沖液、苯丙氨酸均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Digieye電子眼設(shè)備(美國Verivide公司)；TA.HD plus質(zhì)構(gòu)儀(英國Stable Micro System公司)；FX-QS-10精密型強酸性電解水機(煙臺方心水處理設(shè)備有限公司)；SW-002-5G臭氧消毒機(青島維斯特電子凈化設(shè)備有限公司)；YQ205-05紫外可見光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]。

1.3 黃蘑菇保鮮處理

1.3.1室溫保鮮處理 將黃蘑菇先用紫外輻照(UVC， 功率為30 W)正反面分別照射5 min，然后平鋪放入塑料泡沫盒中，從底部通入臭氧(O3)5 min后，分成2組，一組分裝放入保鮮袋，每個保鮮袋大約20朵蘑菇，密封，室溫放置，記為“UVC+O3+氣調(diào)”處理組；另一組平鋪在保鮮袋上敞開放置，記為“UVC+O3+敞開”處理組。

1.3.2低溫儲藏處理 將采后的黃蘑菇分成5組，分別用酸性電解水(AEW)、UVC、O3、UVC與O3混合處理、冷藏處理的方法研究低溫下黃蘑菇的保鮮效果。具體步驟如下：①酸性電解水處理：將黃蘑菇用pH 2.54的AEW浸泡5 min后，瀝干，分裝放入保鮮袋，每個保鮮袋大約20朵蘑菇，密封，4 ℃冷庫儲藏，記為“AEW+4 ℃”處理組；②紫外輻照處理：將黃蘑菇用UVC(功率為30 W)照射5 min，翻面再照射5 min后，分裝放入保鮮袋，每個保鮮袋大約20朵蘑菇，密封，4 ℃冷庫儲藏，記為“UVC+4 ℃”處理組；③臭氧處理：將黃蘑菇在塑料泡沫盒中平鋪一層，塑料泡沫盒下面設(shè)置有進氣孔，上面設(shè)置有出氣口，從底部通入O35 min后，分裝放入保鮮袋，每個保鮮袋大約20朵蘑菇，密封，4 ℃冷庫儲藏，記為“O3+4 ℃”處理組；④紫外與臭氧混合處理：將黃蘑菇先用UVC(功率為30 W)正反面分別照射5 min，然后平鋪放入塑料泡沫盒中，從底部通入O35 min后，分裝放入保鮮袋，每個保鮮袋大約20朵蘑菇，密封，4 ℃冷庫儲藏，記為“UVC+O3+4 ℃”處理組；⑤冷藏處理(對照處理)：對黃蘑菇不做任何處理，每個保鮮袋分裝20朵，密封，4 ℃冷庫儲藏，記為“4 ℃”處理組。

1.4 指標(biāo)檢測

定期取樣觀察外觀品質(zhì)，并檢測相關(guān)指標(biāo)，具體如下。

1.4.2硬度 利用TA.HD plus質(zhì)構(gòu)儀，采用穿刺法檢測不同保鮮處理后黃蘑菇的硬度。具體操作為：選取10朵大小均一的黃蘑菇，沿著菇柄方向橫切，然后取中間部分切成約1 cm厚的薄片，將其放在質(zhì)構(gòu)儀的工作臺上，用P/2E探頭進行硬度的測量，探頭下降和上升速度均為2.0 mm·s-1，測量深度為5 mm。每個菇柄取1個點，菇帽視情況取2～3個點。根據(jù)力隨時間變化的曲線，將在此過程中探頭的最大受力(Nmax)記為所測硬度。

1.4.3失重率 將儲藏于4 ℃冷庫中不同處理組的黃蘑菇取出，稱重，以入庫時的鮮重為基礎(chǔ)，計算其失重率[10]。

1.4.4PPO活性測定 稱取蘑菇樣品1.0 g，加入0.2 g聚乙烯吡絡(luò)烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，液氮研磨成粉后，加入7 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1、pH 6.0)混合均勻，吸入離心管，4 ℃、9 500 r·min-1離心15 min，吸取上清，作為粗酶液備用。反應(yīng)管中加入0.4 mL鄰苯二酚溶液及2.5 mL磷酸緩沖液，于25 ℃水浴中溫浴10 min，再加入0.5 mL粗酶液，于25 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)15 min，迅速放入0 ℃冰水中，靜置3 min終止反應(yīng)，以緩沖溶液調(diào)零，用分光光度計在410 nm下測定其吸光度。將1個活力單位(U)定義為在測定條件下每分鐘引起吸光值改變0.01所需的酶量[11]。

1.4.5PAL活性檢測 參照Koukol等[12]的方法，略作改動，具體操作為：稱取不同處理組的黃蘑菇樣品1.0 g，加入0.2 g PVP，液氮研磨成粉后，加入8 mL硼酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 8.8)，吸入離心管，4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，取上清液作為粗酶液，4 ℃保存待測。反應(yīng)管中加入硼酸緩沖液3.6 mL、0.02 mol·L-1苯丙氨酸2 mL，再加入0.5 mL粗酶液混勻，測定其OD290作為初值，然后置于38 ℃水浴保溫10 min，水浴結(jié)束后測定OD290作為終值。將1個活力單位(U)定義為在測定條件下每10分鐘OD290改變0.01個單位所需的酶量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗監(jiān)測到第42天，在這期間取樣測定指標(biāo)，得到的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保鮮處理室溫保藏后黃蘑菇的感官變化

黃蘑菇多生長在潮濕陰暗的環(huán)境中，喜愛濕度較高、溫度較低的環(huán)境，當(dāng)采收后的黃蘑菇不經(jīng)處理直接在常溫條件下攤放銷售或存放時，黃蘑菇的品質(zhì)會發(fā)生較大變化。如圖1所示，新鮮采收的黃蘑菇，經(jīng)室溫放置2 d后，就會發(fā)粘、收縮、變黑、變軟、表面粘滑，開始腐敗，失去了食用價值。而在室溫條件下，于自封袋密封存放3 d后，黃蘑菇能保持新鮮采收時的感官，但是由于密封不透氣，濕度過高，表面微生物滋生較快，極易產(chǎn)生異味。如圖2所示，經(jīng)UVC和O3復(fù)合處理后敞開放置，黃蘑菇緩慢縮水變小、變軟，且褐變減緩，表面也不易滋生微生物，儲存10 d也沒有腐敗、發(fā)粘、變質(zhì)；而經(jīng)UVC和O3復(fù)合處理后，置于保鮮袋室溫放置，可以較好的保持新鮮黃蘑菇的感官品質(zhì)，第10天時黃蘑菇才略微變黑、變粘。由此可見，若期望有效保持新鮮黃蘑菇的品質(zhì)、延長貨架期，需在采摘后立刻進行適當(dāng)?shù)谋ｕr處理。

圖1 室溫保藏新鮮黃蘑菇

2.2 不同保鮮處理低溫儲藏對黃蘑菇感官品質(zhì)的影響

為了系統(tǒng)、深入的研究黃蘑菇的保鮮方法，結(jié)合上述預(yù)實驗結(jié)果，選用食用菌常用保鮮技術(shù)以及低溫儲藏開展了新鮮采收黃蘑菇的保鮮研究。

2.2.1不同保鮮處理低溫儲藏對黃蘑菇褐變度的影響 褐變包括酶促褐變和非酶促褐變，黃蘑菇的褐變主要是酶促褐變[13]。褐變是導(dǎo)致食用菌感官品質(zhì)下降的重要因素，是衡量食用菌保鮮的重要指標(biāo)。本研究采用電子眼設(shè)備實時在線檢測不同處理組黃蘑菇的褐變程度。L*為白度值，反映樣品“黑”“白”程度，L*值越大，樣品越白，褐變程度越低；褐變指數(shù)BI，綜合L*、a*、b*值的結(jié)果，能夠直接反映樣品的褐變程度。

本研究中電子眼數(shù)據(jù)如圖3所示，結(jié)果表明，除了“AEW+4 ℃”處理組外，其他各處理組的黃蘑菇在42 d的儲藏期內(nèi)均保持較好的感官性狀，L*值呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，對應(yīng)的褐變指數(shù)緩慢增加。隨著儲藏時間的延長，“AEW+4 ℃”處理組的黃蘑菇在儲藏第10天后，白度值L*開始急劇下降，BI急劇上升；第14天時，黃蘑菇表面變得黏膩，顏色由黃色變?yōu)楹稚?；?7天時，超過一半的黃蘑菇已經(jīng)腐爛變質(zhì)。

圖2 “O3 + UVC”處理黃蘑菇室溫保藏

圖3 不同處理低溫儲藏后黃蘑菇褐變度的變化

2.2.2不同保鮮處理低溫儲藏對黃蘑菇硬度的影響 測量黃蘑菇的硬度能直觀的體現(xiàn)出其組織結(jié)構(gòu)的保持性，反映出樣品的新鮮程度。硬度的改變主要和菇體內(nèi)水分的散失有關(guān)，同時，微生物會通過分解產(chǎn)生酶類和內(nèi)源性自溶素，加速細胞壁的降解[14]，造成細胞的萎縮。

不同保鮮處理對黃蘑菇硬度的影響如圖4所示，隨著儲藏時間的延長，除“AEW+4 ℃”處理組外，其他處理組黃蘑菇菇柄的硬度呈緩慢下降趨勢?！癆EW+4 ℃”處理組，黃蘑菇菇柄從第14天開始急速下降，到第22天，由于急速腐敗而無法檢測硬度。與菇柄硬度變化相比，各處理組黃蘑菇菇帽硬度下降趨勢較快?！癆EW+4 ℃”處理組，到第22天，因為嚴(yán)重腐爛而停止檢測菇帽硬度。除“AEW+4 ℃”處理組外，其他處理組菇柄和菇帽硬度在儲藏期間都略高于“4 ℃”處理組，說明UVC和O3對保持黃蘑菇硬度具有較好的效果。

2.2.3不同保鮮處理低溫儲藏對黃蘑菇失重率的影響 黃蘑菇失重率變化和硬度變化有著密切的聯(lián)系，因為造成硬度變化和重量損失主要都是水分散失和自身的代謝降解。不同保鮮處理對黃蘑菇失重率的影響如圖5所示，隨著儲藏時間的延長，黃蘑菇鮮重?fù)p失逐漸增加，且不同處理組間失重率差異不大。儲藏22 d時，“AEW+4 ℃”處理組的黃蘑菇已經(jīng)全部褐變、軟化、滲出液體、表面粘滑、出現(xiàn)異味；而其他處理組儲藏42 d，鮮重?fù)p失不足3%。失重率變化較小可能與包裝材料和儲藏環(huán)境有關(guān)，PE保鮮袋的包裝形成了一個封閉的環(huán)境，自發(fā)氣調(diào)的產(chǎn)生降低了菇體的呼吸和蒸騰作用[15]，而低溫儲藏也在一定程度上降低了菇體的代謝和分解，從而降低了黃蘑菇水分的損失。

圖4 不同處理低溫儲藏后黃蘑菇菇柄和菇帽硬度的變化

圖5 不同處理低溫儲藏后黃蘑菇失重率的變化

2.2.4不同保鮮處理低溫儲藏對黃蘑菇PPO活性的影響 由PPO參與的酶促褐變是導(dǎo)致各種果蔬產(chǎn)品褐變的主要因素。主要反應(yīng)是酚醛類物質(zhì)在有氧參與的條件下，經(jīng)PPO的催化作用，氧化成紅褐色的醌類，這些醌類物質(zhì)進一步聚合，呈現(xiàn)褐色。褐變反應(yīng)中影響最大的因素是蘑菇中的酶量和酶活性[16]。

不同處理對黃蘑菇PPO活性的影響如圖6所示。新鮮黃蘑菇經(jīng)不同保鮮處理后，PPO活性整體均呈現(xiàn)降低的趨勢。“4 ℃”“UVC+4 ℃”“O3+4 ℃”和“UVC+O3+4 ℃”處理組在第4天出現(xiàn)了小高峰，隨后開始下降；“4 ℃”處理組在儲藏第21天二次出現(xiàn)小高峰。從儲藏第1天開始，隨著儲藏時間的延長，除了“AEW+4 ℃”處理組，其他各處理組PPO活力都呈現(xiàn)上升、下降、再上升的趨勢；保藏第4天和第21天均出現(xiàn)了活力峰，“4 ℃”處理組的活力峰最高；其他各處理組中，“臭氧+4 ℃”處理組的活力高峰低于或者晚于其他處理組，反映出臭氧能夠在一定程度上破壞或抑制PPO的活力?！癆EW+4 ℃”處理組在儲藏前7天就出現(xiàn)了品質(zhì)的快速下降，PPO活力也在前7天快速降低，活力峰整體呈現(xiàn)平緩趨勢，儲藏第10天才出現(xiàn)第1個活力峰。

圖6 不同處理低溫儲藏后黃蘑菇PPO活性的變化

2.2.5不同保鮮處理低溫儲藏對黃蘑菇PAL活性的影響 PAL也參與黃蘑菇酶促褐變的過程，其通過催化作用，直接脫掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸。對其含量的測定可以從次級代謝產(chǎn)物的角度體現(xiàn)出酶促褐變的情況。

由圖7可知，隨著儲藏時間的延長，不同處理組黃蘑菇的PAL活性總體上呈現(xiàn)下降趨勢。除了“AEW+4 ℃”處理組，其他處理組在整個儲藏過程中波動較大，在儲藏第16天，“4 ℃”“O3+4 ℃”處理組分別出現(xiàn)最高峰值5.99 U·g-1和3.71 U·g-1。說明整個儲藏過程中低溫、UVC和O3有效地干擾了PAL活性，但是沒有徹底滅活該酶?！癆EW+4 ℃”處理組在儲藏0～7 d呈現(xiàn)緩慢上升，然后在10～22 d呈現(xiàn)緩慢下降并趨于平緩，儲藏第7天最高峰值也只有2.53 U·g-1，低于“4 ℃”“O3+4 ℃”處理組第16天出現(xiàn)的最高峰值。這可能是由于PAL不耐酸堿，特別是對酸極為敏感[17]，經(jīng)酸性電解水處理后，黃蘑菇PAL活性部分喪失。

圖7 不同處理低溫儲藏后黃蘑菇PAL活性的變化

3 討論

黃蘑菇味道鮮美、香味濃郁，然而新鮮采收的黃蘑菇儲存期較短，2～3 d后就會縮水、變軟、變黑，極易失去食用價值和商品價值。放入自封袋儲藏后，由于新鮮蘑菇的呼吸和蒸騰作用，揮發(fā)的水分保持了黃蘑菇新采收時的感官品質(zhì)，但是也促進了微生物生長，產(chǎn)生難聞的腐敗氣味。

考慮到適當(dāng)?shù)谋ｕr技術(shù)處理和低溫儲藏能夠有效增加食用菌的貨架期，本研究開展了黃蘑菇的保鮮處理和低溫儲藏研究。相對于其他食用菌的保鮮研究，本研究將西藏高原特色的野生黃蘑菇作為研究對象，利用多種保鮮技術(shù)進行單一和復(fù)合處理，結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)腢VC和O3處理，外加保鮮袋收集和低溫儲藏有助于保持新鮮黃蘑菇的色澤、硬度和濕重，儲藏42 d后各項感官指標(biāo)劣化程度在可接受范圍內(nèi)。UVC和O3處理還有助于殺滅黃蘑菇表面細菌，淬滅新鮮蘑菇活性生物酶[18-19]；與低溫儲藏相比，UVC和O3處理可以適當(dāng)?shù)难泳忺S蘑菇腐敗變質(zhì)、菌體自溶。AEW處理雖然也有抑制外源菌和生物酶活性的作用，但是黃蘑菇自身水分含量較少且肉質(zhì)厚，AEW處理后使得黃蘑菇大量吸收水分，反而更有助于微生物的滋生，因此，“AEW+4 ℃”處理組的黃蘑菇在儲藏的第10天就開始急速變軟、變黑、變粘、腐爛和自溶。

采收后的食用菌易發(fā)生褐變，褐變是決定食用菌采后食用品質(zhì)和商品價值的首要指標(biāo)。食用菌褐變分為酶促褐變和非酶促褐變，以酶促褐變?yōu)橹?。酶促褐變的褐變度與PPO、過氧化物酶(peroxidase，POD)和PAL等的活力呈正相關(guān)，相關(guān)性大小為PPO>POD>PAL[20]。食用菌保鮮中，常通過檢測PPO和POD的活性，反映樣品的褐變程度；PAL也作為一個輔助指標(biāo)來體現(xiàn)酶促褐變的情況，PAL通過催化植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)的產(chǎn)生而影響酶促褐變，其活性往往作為酚類褐變的指標(biāo)[21]。

本研究通過檢測PPO和PAL活性探究了黃蘑菇儲藏期間的褐變原因。AEW、UVC和O3處理都有效抑制了PPO的活性，低溫儲藏也有效降低了PPO的活性，所以在整個儲藏期間，PPO活性呈現(xiàn)下降趨勢。而PAL活性在整個儲藏期間波動較大，PAL對pH的耐受性較差，在酸性和堿性環(huán)境中易失活，所以“AEW+4 ℃”處理組的PAL活性趨于穩(wěn)定。

綜上所述，保鮮袋儲藏、低溫儲藏和適當(dāng)?shù)腢VC和O3保鮮處理有助于保持新鮮黃蘑菇的感官品質(zhì)，有效延長其貨架期。然而，對于水分含量較少的高原黃蘑菇而言，AEW處理并不適用于其保鮮，處理后外來水分的帶入，反而加速了其腐敗變質(zhì)。本研究為黃蘑菇的保鮮奠定了理論基礎(chǔ)，但是仍有不完善的地方，如針對每種保鮮技術(shù)參數(shù)，有待進一步的細化深入；對于不同保鮮處理后黃蘑菇的品質(zhì)改變和褐變機制，有待開展深入的探索研究。