古麗米熱·依米提, 斯坎德爾·白克力, 王延蛟

新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830011

肝癌是常見的惡性腫瘤之一, 其發(fā)病機(jī)制與癌基因的激活有關(guān)[1]。目前，對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的研究主要集中在腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控方面[2]。DEN二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)對(duì)人體和動(dòng)物都存在劇毒性,即使是小劑量注射或口服給藥也會(huì)造成嚴(yán)重的肝損傷。DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型是目前研究分析人類肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和過程的理想動(dòng)物模型[3]。非編碼小RNA與腫瘤類型密切相關(guān)[4]。非編碼RNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，PIWI相互作用RNA(piRNA)是一種非編碼RNA[5]。Aravin等[6]在雄性小鼠睪丸組織中分離出一段小RNA，該RNA主要與Argnaute家族PIWI蛋白成員相互作用而將其命名為piRNA，piRNA是長度約為24～31 nt的新型非編碼RNA，piRNA在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[7]。piRNA不僅參與生殖細(xì)胞的調(diào)控，而且在宮頸癌、胃癌、乳腺癌和膀胱癌等多種癌細(xì)胞中均檢測(cè)到piRNA的異常表達(dá)[8]，piRNA與PIWI蛋白家族成員相結(jié)合才能發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明，PIWI和piRNA的表達(dá)水平與腫瘤類型密切相關(guān)。PIWI/piRNA調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性表達(dá)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的修飾[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中PIWI蛋白高表達(dá)，PIWI蛋白異常表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度顯著相關(guān)[10]。PIWI可能還參與胃癌和其他癌癥的發(fā)展，并且是癌癥診斷的一個(gè)潛在標(biāo)記[11]。PIWIL2 mRNA在肝癌中的表達(dá)量比腫瘤周圍的肝臟組織的表達(dá)量高(P<0.05)，Piwil2基因mRNA的表達(dá)與PIWIL2蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)，PIWIL2有可能成為肝癌的檢測(cè)及治療的分子標(biāo)志物[12]。PIWIL2可以通過控制p53作為STAT3信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)，使p53基因發(fā)生修飾和沉默，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮癌基因的作用[13]。PIWI/piRNA通路相關(guān)基因Piwil4、Mael和Ddx4作為候選癌基因在多種癌組織中表達(dá)，而在肝癌組織中的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究以建立的大鼠肝癌動(dòng)物模型為研究對(duì)象，通過ELISA方法檢測(cè)肝癌模型各組血清腫瘤標(biāo)記物驗(yàn)證大鼠肝癌病證動(dòng)物模型；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印跡技術(shù)(Western-blot)和免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)肝癌模型組織中Piwil4、Mael、Ddx4基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，探討Piwil4、Mael、Ddx4基因在肝癌中表達(dá)水平變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康雄性40只Wistar大鼠(提供單位：新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：65000700000538)，體重約(150±10)g，月齡約為6月。DEN購自Sigma公司。Mael、Piwil4、Ddx4和GAPDH引物合成自上海生工公司，Mael、Piwil4、Ddx4和GAPDH兔抗鼠單克隆抗體購自ABCAM公司，RNA提取試劑盒購自聚合美生物公司，蛋白裂解液購自Thermo公司。

1.2 肝癌動(dòng)物模型建立與分組

選取雄性Wistar大鼠40只，飼養(yǎng)3 d后大鼠隨機(jī)分成肝癌模型組(自由飲用滅菌水配制的濃度為0.1 mg·mL-1的DEN 溶液，20只)和正常對(duì)照組(飲用滅菌水，普通飼料飼養(yǎng)，20只)。滿20周處死動(dòng)物并取肝組織 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察大鼠肝癌模型肝組織病理形態(tài)學(xué)特征

分別取肝癌組小鼠肝組織和正常組小鼠肝組織，4% PFA溶液固定，石蠟包埋兩組肝組織切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理切片檢測(cè)組織形態(tài)特征。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)測(cè)定模型各組中的腫瘤標(biāo)記物(HSP、ARF、ASMA)

取血后，室溫下血液凝固2 h，4 ℃過夜，離心(3 000 r·min-1，4 ℃，10 min)，棄不溶物，將血清移至試管，置于-80 ℃保存。按照AFP-L3、HSP-70、ASMA ELISA試劑說明書要求，配標(biāo)準(zhǔn)曲線(AFP：64、32、16、8、4、0 ng·mL-1；HSP：400、200、100、50、25、0 pg·mL-1；ASMA：200、100、50、25、12.5、0 IU·L-1)，加入標(biāo)準(zhǔn)液，加入樣品，洗滌，測(cè)450 nm分光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組血清中腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)量。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)法檢測(cè)Piwil4、Mael和Ddx4基因的mRNA表達(dá)

用加強(qiáng)型組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(聚合美生物公司)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用引物均由上海生工公司合成，引物序列見表1。

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR按 SYBR Green RT-PCR試劑盒的操作步驟進(jìn)行。充分混勻以上反應(yīng)體系(25 μL)：12.5 μL SYBR Premix ExTaqTM，10.3 μL dd H2O，1 μL cDNA模板，1.6 μL上游引物，1.6 μL下游引物。PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，Tm30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s延伸，40個(gè)循環(huán)(由設(shè)定點(diǎn)溫度增加0.5 ℃/s)。結(jié)果用目的基因在肝癌模型組相對(duì)于正常對(duì)照組的mRNA相對(duì)模板表達(dá)量差異倍數(shù)用2-ΔΔCt方法來計(jì)算，其中ΔΔCt=(CtTarget-CtGAPDH)處理-(CtTarget-CtGAPDH)對(duì)照。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列及擴(kuò)增片段

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測(cè)Piwil4、Mael和Ddx4基因在蛋白的表達(dá)

20周后處死動(dòng)物并取各組肝組織立即用液氮研磨，加蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。加6×電泳上樣緩沖液沸水浴10 min，SDS-PAGE電泳(80 V 30 min，100 V 40 min)，PVDF轉(zhuǎn)膜(80 mA,2 h 30 min)，封閉，一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH 1∶5 000; PIWIL4 1∶1 000；MAEL 1∶2 000；DDX4 1∶1 000)，TBST洗膜5次，HRP標(biāo)記(山羊抗兔1∶10 000)的二抗孵育2 h，TBST洗膜5次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Piwil4、Mael和Ddx4基因的蛋白表達(dá)水平

60 ℃溫箱中烘烤60 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡15 min，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡5 min，洗滌；用沸騰的10 mmol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液洗滌，3% H2O2-甲醇溶液中洗滌15 min，5%山羊血清室溫封閉40 min，加一抗過夜，洗滌，加酶標(biāo)二抗孵育40 min，洗滌，DAB顯色液顯色10 min，蒸餾水終止顯色，蘇木素染液復(fù)染10 min，脫色反藍(lán)，封片，顯微鏡拍片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 肝癌組織病理形態(tài)學(xué)特征

成功建立大鼠肝癌模型，正常組大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)正常。肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見纖維間隔，未見細(xì)胞水腫，未見壞死肝細(xì)胞(圖1)。肝癌模型組大鼠肝細(xì)胞呈多角形，異型性明顯，胞漿豐富，嗜酸性，核大，圓形，有清楚的核仁。分化差異癌細(xì)胞異型性明顯，常有巨核及多核瘤細(xì)胞(圖1)。

圖1 HE染色觀察肝臟病理形態(tài)特征

2.2 肝癌模型組織中腫瘤標(biāo)記物(HSP、ARF、ASMA)表達(dá)水平

結(jié)果(圖2)表明，腫瘤標(biāo)記物AFP肝癌模型組(6.70±3.17)與正常對(duì)照組(0.98±0.13)差異極顯著(P<0.05)；腫瘤標(biāo)記物ASMA肝癌模型組(62.63±2.65)與正常對(duì)照組(48.09±4.23)差異極顯著(P<0.05)；腫瘤標(biāo)記物HSP肝癌模型組(27.43±3.18)與正常對(duì)照組(6.64±4.57)差異極顯著(P<0.05)。

圖2 肝癌模型組織中腫瘤標(biāo)記物表達(dá)變化

2.3 肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因的mRNA表達(dá)水平

結(jié)果(圖3)表明，肝癌模型組織中Piwill4、Mael和Ddx4mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為114.8±15.74、5.66±2.02、15.07±6.17，正常對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.18±0.23、1.27±0.27、1.57±0.49。在肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA表達(dá)水平明顯高于正常肝組織(P<0.05)。

2.4 Western-blot法檢測(cè)肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達(dá)水平

結(jié)果(圖4)表明，肝癌模型組中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達(dá)水平分別為2.23±0.49、0.14±0.02、1.36±0.12，正常對(duì)照組蛋白表達(dá)水平分別為0.85±0.15、0.04±0.05、0.71±0.11。在肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4 蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的正常肝組織(P<0.05)。

圖3 肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

圖4 肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達(dá)水平

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達(dá)水平

結(jié)果(圖5)表明，肝癌模型組中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達(dá)水平分別為879.9±12.64、904.6±8.73、874.8±7.95，正常對(duì)照組蛋白表達(dá)水平分別為292.0±3.55、343.1±8.05、290.5±6.09。在肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的正常肝組織，在肝癌模型組織中高表達(dá)(P<0.05)。

圖5 PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白的表達(dá)水平

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康，目前認(rèn)為其發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素雙重影響。對(duì)肝癌的發(fā)生及發(fā)展主要集中在腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控等方面的研究。

PIWI/piRNA不僅在人睪丸和造血干細(xì)胞大量表達(dá)，也在多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株有異常表達(dá)。在乳腺癌等腫瘤中，PIWI蛋白在腫瘤表達(dá)量與惡性程度呈正相關(guān)[14]。PIWI蛋白含量用于判斷腫瘤惡性程度在胃癌、胰腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肉瘤和肝細(xì)胞癌的研究中已得到證實(shí)[15]。

Piwil2與Piwil4都是PIWI家族亞成員，PIWIL2在惡性腫瘤中過度表達(dá)使抑癌基因沉默，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[16]。Piwil2基因的高表達(dá)誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-xL的過表達(dá)，引起STAT3基因的表達(dá)上升，激活STAT3/BCL-XL通路抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。在結(jié)腸癌及其癌旁組織中，Piwil2的異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與病人生存期呈負(fù)相關(guān)[18]。PIWIL4蛋白參與修復(fù)p53蛋白的突變，促進(jìn)p53蛋白發(fā)揮功能[19]，PIWIL4蛋白的低表達(dá)會(huì)影響miRNA的穩(wěn)定性[20]。2010年蘇暢等[21]發(fā)現(xiàn)Piwil4基因在人宮頸癌組織中的表達(dá)水平較正常組織髙，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長活性和增殖能力，并能抑制其凋亡。

Mael與Ddx4(Vasa)基因與PIWI通路相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Mael基因在結(jié)直腸癌等癌組織中異常高表達(dá)[22]。徐景波等[23]研究發(fā)現(xiàn)DDX4高表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。李斌等[24]研究發(fā)現(xiàn)，靶向沉默Ddx4基因可明顯抑制裸鼠食管鱗癌細(xì)胞成瘤，Ddx4基因沉默可能是通過抑制 PI3K的活性，由此參入并下調(diào) PI3K/Akt 信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

本研究對(duì)肝癌模型中的腫瘤標(biāo)記物在肝癌模型組織中的腫瘤標(biāo)記物含量高于正常對(duì)照組含量，可以推測(cè)腫瘤標(biāo)記物在肝癌模型組織中的表達(dá)升高。qRT-PCR及Western-blot方法檢測(cè)，結(jié)果表明肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的正常組織(P<0.05)。Piwil基因mRNA的表達(dá)與PIWIL蛋白質(zhì)的表達(dá)有相關(guān)性。提示Piwi基因的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)與肝癌的惡性程度及預(yù)后有關(guān)。綜上所述，研究表明，Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA及蛋白在肝癌模型組織中高表達(dá)，對(duì)肝癌的早期診斷提供一定的依據(jù)。肝癌模型組織中PIWI基因表達(dá)水平有望作為肝癌的檢測(cè)及治療的一種分子標(biāo)志物。