於明明 陳 方,2,3

在小兒泌尿外科，很多先天性疾病及外傷都需要足夠的自體組織用于重建修復。傳統(tǒng)手術治療能在一定程度上解決很多問題，但也存在不少并發(fā)癥。以兒童膀胱重建為例，目前臨床上主要采取腸膀胱成形術，但其并發(fā)癥繁多，包括尿路感染、尿漏、結石、代謝紊亂、腸黏膜分泌物多，甚至惡變等[1,2]。此外，很多患兒缺乏足夠的自體組織用于重建，也會限制手術的實施。此時，組織工程技術是一個很好的替代選擇，它將細胞與生物材料、生物工程原理相結合，制造出與目標組織具有相似結構和功能的替代組織。組織工程技術較傳統(tǒng)手術方式最大的優(yōu)勢在于無需犧牲自體替代組織，不僅可以減輕手術創(chuàng)傷，而且能夠很好地解決部分患兒因尿路缺損面積過大或者需要多次手術造成的自體替代組織不足的難題。組織工程技術已經能夠構建出與正常組織結構相似并具有一定功能的膀胱和尿道組織，但在實際臨床應用中的效果并不理想，這些工程化的下尿路組織移植到患兒體內后容易發(fā)生纖維化和結構改變，且重建部位的功能也難以達到正常水平。因此，利用組織工程技術重建和修復尿路缺損的效果尚不如傳統(tǒng)手術方式，遠未達到彌補傳統(tǒng)手術不足的效果，這也促使研究者們不斷重認識、重思考[3,4]。

一、下尿路組織工程的臨床前研究

組織工程最基礎的兩個組成部分是支架和種子細胞，細胞是工程化組織的來源，而支架為細胞的增殖、分化以及遷移等行為提供空間，并且為組織形成提供結構支持[5]。

尿路的結構與功能特點對支架的選擇提出了很高的要求。一個理想的支架應包含以下特性：良好的生物相容性、可有序降解性、特定的空間結構、適當?shù)牧W強度以及能為細胞提供良好的生物環(huán)境。目前常用的支架主要有天然支架和人工合成支架。天然支架主要來源于機體組織或天然高分子聚合物，如小腸黏膜下層(small intestine submucosa，SIS)、膀胱脫細胞基質以及膠原蛋白、絲素蛋白等，其優(yōu)點在于具有良好的生物活性、生物相容性以及低免疫原性，缺點是差異性較大、制備及滅菌存在一定困難[6-10]。而人工合成支架常以合成的高分子聚合物為材料，如聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內酯、聚乙二醇、聚乳酸-乙醇酸等，其性質均一，產量高，可調節(jié)性強，但在生物活性、免疫原性及炎癥反應等方面表現(xiàn)不如天然材料[11-15]。

常見的種子細胞主要包括各種成熟細胞和干細胞。自體的尿路上皮細胞和平滑肌細胞是兒童下尿路組織工程技術最常用的種子細胞，因其不存在免疫反應及炎癥反應，已被多次應用于臨床研究中[16]。而干細胞具有良好的分化性、可塑性、自我更新能力，且能夠調節(jié)免疫反應、炎癥反應、血管化水平等，常用來彌補成熟細胞的不足，在臨床前研究中有著廣泛的應用[5]。

下尿路組織工程技術已經在臨床前研究中取得了不錯的成果，在諸多動物(如大鼠、兔、狗及豬等)體內能重建出接近正常結構和功能的膀胱與尿道，顯示出組織工程技術在下尿路重建修復中的強大優(yōu)越性，并為其臨床轉化奠定了一定基礎[17-20]。

二、組織工程技術在兒童下尿路重建修復中的臨床應用

1. 膀胱:據(jù)文獻報道，有30例患兒利用組織工程技術重建修復了膀胱。早在十幾年前，Atala等[21]首次將成熟的組織工程技術應用于臨床。該研究對7例脊髓脊膜膨出伴膀胱疾病的患兒通過膀胱活檢術取得膀胱上皮細胞及平滑肌細胞，在體外培養(yǎng)擴增后將這些自體細胞接種在可降解的膠原支架或膠原-PGA復合支架上，隨后移植到體內重建膀胱并伴或不伴大網膜包裹，取得了初步成效。研究結果表明使用復合支架并伴大網膜包裹的膀胱重建效果相對較好，漏尿點壓、容量及順應性均有改善，但重建后膀胱的順應性及容量隨年齡繼續(xù)增長的效果難以令人滿意。隨后，Joseph等[22]利用相似的方法在10例神經源性膀胱患兒中進行了二期臨床研究，但結果仍不理想。該研究采用自體膀胱上皮細胞及平滑肌細胞結合聚乙酸/聚乳酸可降解支架，術后1年和3年隨訪，發(fā)現(xiàn)患兒膀胱容量和順應性沒有顯著改善，所有患兒出現(xiàn)了并發(fā)癥，其中4例出現(xiàn)了嚴重腸梗阻或膀胱破裂。SIS是臨床使用最多的天然支架，并且可以不結合細胞而單獨應用，盡管此前SIS在臨床前研究中取得了不錯的效果，但臨床應用時效果很一般。Caione等[23]將SIS移植到5例膀胱外翻術后膀胱功能欠佳的患兒體內重建膀胱時，發(fā)現(xiàn)SIS植入后可以逐漸被正常膀胱上皮和肌層替代，術后6個月膀胱容量和順應性有明顯改善，證明了SIS重建膀胱的可行性；但重建的膀胱組織中肌肉含量很低，術后18個月隨訪發(fā)現(xiàn)膀胱容量及順應性沒有持續(xù)顯著提升。同樣，Schaefer等[24]利用SIS對6例患兒(1例膀胱外翻術后、1例膀胱輸尿管反流術后、2例脊柱裂和2例膀胱外翻)重建膀胱，效果也不理想。該研究發(fā)現(xiàn)SIS雖然可以轉化為膀胱組織，但其中結締組織含量過高，僅2例形成了規(guī)則的尿路上皮；術后膀胱順應性沒有顯著提升，并且有3例出現(xiàn)了并發(fā)癥(2例膀胱結石和1例膀胱破裂)。另外，Zhang等[25]通過對15例神經源性膀胱患者(含2例兒童)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，SIS重建膀胱的遠期成功率為60%(膀胱容量和最大逼尿肌壓有了顯著改善)，有1例患兒術后出現(xiàn)了膀胱結石。值得一提的是，Schaefer等[24]還發(fā)現(xiàn)膀胱外翻患者行自體細胞重建的膀胱組織中依然會出現(xiàn)膀胱外翻的病理變化-Von Brunn細胞巢，證實病態(tài)組織來源的成熟細胞會將其病理特性傳遞到其重建的組織中[26]?？偟膩碚f，組織工程技術在兒童膀胱重建修復中的初步應用效果一般，雖然重建的膀胱在短期內順應性和容量提升尚可，但難以具備與年齡增長相匹配的持續(xù)提升能力，并且面臨相對較高的術后并發(fā)癥發(fā)生率，其效果尚不及傳統(tǒng)手術的效果。

2. 尿道：組織工程技術在兒童尿道重建修復中的臨床研究相比膀胱較少，目前研究共涉及16例患兒。Fossum等[27]最早將通過膀胱灌洗獲得的膀胱上皮細胞在體外擴增后接種在脫細胞真皮上重建尿道治療重度尿道下裂，術后6例患兒均能以站姿從成形的尿道口正常排尿，這說明了組織工程技術重建兒童尿道的可行性；但術后(隨訪3～5.5年)并發(fā)癥相對較多，包括1例尿道狹窄、1例吻合口梗阻及2例尿道瘺。Bhargava等[28]研究通過口腔黏膜活檢分離培養(yǎng)角化細胞和成纖維細胞，隨后將兩者接種到去真皮脫細胞基質上，再將其用于5例尿道狹窄(由硬化性苔蘚引起)患兒的尿道重建修復，雖然初次移植的成功率為100%，但在隨后近3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)5例患兒均出現(xiàn)了輕重不一的并發(fā)癥，其中2例因尿道纖維化或尿道收縮需要完全或部分切除重建的尿道段，整體遠期成功率為零。Raya-Rivera等[29]研究結果相對樂觀很多，研究者通過膀胱活檢術獲取5例尿道膜部損傷患兒的自體膀胱上皮細胞和平滑肌細胞，分離培養(yǎng)后分別接種于管狀聚乙醇酸支架的內外兩層，然后植入體內重建后尿道。結果顯示僅1例術后2周出現(xiàn)了尿道狹窄(隨后行尿道內切開術解決)，術后3個月尿道活檢顯示所有重建的尿道結構正常，長期隨訪(6年)未發(fā)現(xiàn)尿道狹窄，表明這種管狀的組織工程化尿道可以用于臨床治療，并且可以在患兒體內持續(xù)作用6年以上。由此可見，以尿道下裂及外傷為主的兒童尿道重建是一個復雜的難題，而組織工程化尿道為解決這個難題提供了一個初步可行但仍需繼續(xù)改進的新方法[30]?？偟膩碚f，已有臨床研究展示出了組織工程技術在兒童下尿路重建修復中的初步可行性和一定的短期成功率，但在遠期成功率及并發(fā)癥方面仍不理想，整體效果尚未達到臨床前研究的預期。

三、臨床轉化失敗的主要原因

組織工程技術重建修復兒童下尿路從臨床前研究向臨床研究的轉化在已有研究中基本是失敗的，當前面臨的問題大致可總結如下：首先，臨床前研究常采用健康的動物，不能準確模擬病態(tài)組織的結構和功能。健康動物來源的細胞各種特性均正常；而有研究顯示，從先天性下尿路疾病患兒體內分離培養(yǎng)的成熟細胞在體外增殖、分化、黏附及收縮能力等諸多方面都會有別于正常細胞，甚至還有可能繼承和傳遞某些病理特征，這對臨床應用的效果可能會產生一定的影響[31-33]。因此，目前在健康動物中取得的成功很難復制到患有先天性疾病的兒童中。其次，移植物的血供沒有受到足夠重視。移植物用于重建時需與周圍組織通過緩慢的芽生方式建立血運才可存活，而組織內氧氣擴散的最大距離只有100～200 μm，這勢必會影響移植物的存活與重建效果，尤其是對于面積或體積大的移植物[34,35]。這一點從Atala等[21]研究中也可以看出，大網膜作為目前常用的體內血管床，包裹移植物后可以明顯提高膀胱重建修復的效果。目前，臨床前研究已探索出多種有效改善移植物血供的方法，但由于受各種因素限制尚未應用到臨床研究中。此外，目前研究多注重結構重建，而忽略了功能恢復。功能重建對于膀胱來說尤為重要，膀胱除了像尿道一樣需要具備一定的結構和容量，還需要有合適的充盈以及收縮能力,重建后膀胱功能缺失會帶來很多并發(fā)癥。因此，通過各種手段(如利用干細胞或生長因子在分子水平調控移植物的生長環(huán)境)促進重建組織功能恢復也很重要[36]。最后，長期隨訪對于兒童尤為重要。兒童是一個特殊的群體，其生理特點對重建組織提出了很高的要求，如良好的生長潛能、穩(wěn)定的結構與成分以及長期的使用壽命等[37]。以膀胱重建為例，成年患者重建后的膀胱只需獲得可維持的容量及順應性提升即可，而對于兒童重建后的膀胱還需要具備與年齡增長相匹配的生長能力。這也是目前臨床研究面臨的問題，雖然目前從短期來看效果尚可，但長期效果遠未能達到滿意。

四、啟示與策略

臨床轉化失敗迫使尿路組織工程研究做出改變。首先，臨床前研究應當使用患有相應疾病的動物模型。兒童下尿路重建修復以各種先天性疾病最為常見，因此在臨床前研究中不能簡單地選用尿路機械性損傷或部分切除的動物模型，而要選用具有相應原發(fā)疾病的動物模型。目前，很多小兒泌尿外科疾病都有了成熟的動物模型，如神經源性膀胱、尿道下裂及膀胱梗阻等[38-40]。此外，大動物比小動物更適合組織工程研究，因為其更能模擬人體狀態(tài)[41]。因此，臨床前研究中動物模型的選擇應由健康動物模型向患病動物模型、從小動物向大動物逐漸轉變，這樣才能更好地向臨床研究轉化。

其次，需要充分利用干細胞的優(yōu)勢。干細胞除了能定向分化、促進組織血管化、調節(jié)免疫反應和炎癥反應等以外，其分化而來的平滑肌細胞在組織工程中的應用效果似乎也比成熟的平滑肌細胞更好[42,43]。有研究顯示脊柱裂患兒來源的干細胞與健康個體來源細胞的再生潛能相似，這一點對于兒童有著重要的意義，因為兒童下尿路缺損以先天性疾病為主，其來源的成熟細胞相比于正常細胞，多種能力有明顯差異，且很可能會繼承和傳遞某些病理特征，進而影響工程化組織的使用效果。因此，在兒童下尿路組織工程中使用干細胞似乎可以避免成熟自體細胞帶來的弊端[44]。此外，多種來源的干細胞(如骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞等)都已被用于臨床前研究，豐富了種子細胞的來源，并且一些新興的、可以無創(chuàng)獲取的干細胞(如尿源性干細胞)降低了取材的難度，減輕了創(chuàng)傷[45-47]。

第三，血供不僅關系著移植物的存活，更決定了其結構和功能恢復的程度。目前，在臨床前研究中促進血管化的手段有很多，除了調節(jié)支架特性及應用生長因子等傳統(tǒng)方法以外，很多研究將種子細胞和血管生成相關的細胞如內皮細胞或內皮祖細胞等共培養(yǎng)，并取得了很好的效果[48,49]。內皮細胞可與間充質干細胞、成骨細胞、心肌細胞等多種細胞共培養(yǎng)，還可以包裹在兩層細胞膜片之間，這樣構建的細胞膜片在移植前就具備了豐富的內部微血管網絡[50-53]。此外，還有研究者嘗試了將預血管化后的移植物連同其下方軸心血管一同移植的方法，將構建的組織先在含軸心血管的體內或體外生物反應器中預血管化，離斷軸心血管后隨組織一起移植并與宿主大血管相吻合[52,54]。Sekine等[52]研究結果顯示，心肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)的細胞膜片在體外生物反應器預血管化后會提高其活性，而移植時軸心血管吻合會大幅提升這一效果。由此可見，在組織內預先構建微血管網絡固然重要，但更重要的是能及時將這些微血管網絡通過大血管與宿主的循環(huán)系統(tǒng)連接起來。

第四，生長因子能促進細胞增殖、分化及組織結構和功能的再生，對組織工程有重要的促進作用。但生長因子在體內很不穩(wěn)定，因此實現(xiàn)可控、緩慢釋放才能使其持續(xù)發(fā)揮作用。目前，多種由天然材料或者合成材料構建的支架都可以實現(xiàn)將生長因子包裹后在體內緩慢釋放[55,56]。此外，針對無支架的細胞膜片，有研究者設計了一種能包裹血管內皮生長因子的纖維墊，將其加蓋在六層心肌細胞膜片上可以實現(xiàn)血管內皮生長因子緩慢釋放[57]。這些控制生長因子在體內緩慢釋放的方法在組織工程中有很好的應用前景。

最后，組織重建修復過程中細胞間相互作用和信號通路等問題應當被重視并加以利用。以巨噬細胞為例，它分為有促炎作用的M1型和有抗炎作用的M2型，是組織血管化和功能重建的重要參與者[58]。在移植前期M1型占主導地位可以促進血管生成，而在移植后期M2型占主導地位可以促進組織功能恢復及減少瘢痕形成[59]。因此，通過改變支架性質或應用生長因子等方法調節(jié)不同時期兩型巨噬細胞的表達，可以促進移植物結構和功能的重建[60]。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)BAM單獨使用和聯(lián)合ADSCs重建膀胱時，重建的組織在基因表達和信號通路上存在較大的差異，說明ADSC能通過多條信號通路改變膀胱愈合的分子機制，這些信號通路可以作為促進尿路重建修復效果的靶點[61]。

五、小結與展望

綜上所述，多種支架材料和細胞已經被用于兒童下尿路組織工程研究，并且在臨床前研究中取得了不錯的效果，但臨床前研究向臨床研究轉化的初步結果不理想，雖然體現(xiàn)出了初步的可行性，但在遠期成功率和并發(fā)癥方面的表現(xiàn)遠不如傳統(tǒng)手術。轉化失敗的原因主要包括：常選擇健康的動物模型，缺少從小動物向大動物的過渡；未重視移植物的血供；注重結構重建而忽略了功能恢復；缺少長期隨訪等。針對這些問題，很多解決策略也應運而生，如應用患有相應疾病的動物模型，發(fā)揮干細胞的優(yōu)勢，移植物預血管化或帶血管蒂移植，使用能可控緩慢釋放生長因子的“智能支架”，深入研究組織再生過程中的細胞間相互作用及分子機制等。但有一點可以肯定的是，單用一種方法很難解決目前的問題，只有綜合多種方法才能實現(xiàn)最終的臨床應用。

組織工程技術在兒童下尿路重建修復中已經顯示出了初步的可行性和一定的短期成功率，它作為一種新興技術具有良好的發(fā)展前景。隨著研究的逐漸深入以及研究者們對組織工程技術和兒童下尿路重建修復認識的逐漸增加，工程化組織的效果會越來越好，并且可能最終完全替代自體組織。