彭京蘭 馬暢 吳曉梅

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)具有較高的發(fā)病率和死亡率，預(yù)計到2020年將成為全球疾病死亡率的第三大原因[1]，其現(xiàn)行治療方案旨在緩解癥狀，避免急性加重，提高患者的生活質(zhì)量，但不能阻止其進展或修復(fù)受損肺組織及功能，無法降低該疾病的死亡率。因此，迫切需要研究針對COPD新的治療方法以解決此難題。

肺是由40多種不同的分化類型細胞組成的復(fù)雜器官，不同的祖細胞群位于成年人類肺的不同解剖區(qū)域(例如肺上皮干細胞)。通過動物模型實驗及臨床試驗發(fā)現(xiàn)，組織特異性干細胞和骨髓來源干細胞能夠促進受損傷的肺再生新的肺組織。這提示我們，通過給予外源性干/祖細胞或激活內(nèi)源性干/祖細胞來達到治療COPD的目的，是一種新的可行的治療方案[2]。

呼吸系統(tǒng)的內(nèi)源性干細胞種群

一、大氣道干細胞的作用

肺內(nèi)氣管和左、右主支氣管內(nèi)的假復(fù)層上皮中，含有基底細胞，屬于未分化的干細胞，在其表面表達CD44、CD49f、CD151、CD166、神經(jīng)生長因子受體(NGFR)、表皮生長因子受體(EGFR，參與組織修復(fù)的調(diào)控)，并且在其胞質(zhì)中表達細胞骨架細胞角蛋白CK5，CK14和CK17，組織因子(TF)及其胞質(zhì)和/或細胞核中的蛋白 Trp-63(p63)。p63是p53家族的轉(zhuǎn)錄因子。p63能夠拮抗 p53的功能，可以調(diào)節(jié)細胞凋亡和細胞周期，以保證基礎(chǔ)細胞的存活和更新[3]。研究表明在人支氣管基底細胞中敲除 p63 會顯著降低其增殖和遷移[4]。

從功能上講，人氣管支氣管上皮的基底細胞就是干細胞，因為其在體內(nèi)(異種移植)和體外均可重構(gòu)成完全分化的黏膜纖毛上皮。有實驗證明，將人支氣管基底細胞移植到被萘損傷了氣管及支氣管的小鼠模型中，產(chǎn)生了完全分化的上皮[5]。人體內(nèi)的滋養(yǎng)層細胞表面抗原2(TROP2)是在許多癌癥中高度表達的跨膜糖蛋白，具有干細胞樣特性，為細胞存活和增殖提供了信號[6]，在吸煙患者中觀察到，在TROP2作用下，基底細胞增殖率明顯升高[7]，因此我們推測，或許可以通過TROP2促進氣管、支氣管基底細胞的分化再生這一方式來達到治療COPD的目的。

有研究發(fā)現(xiàn)通過支氣管內(nèi)活檢在COPD 患者的次級支氣管中獲得的支氣管基底細胞數(shù)目(CK5+/CK14+/p63+)顯著減少；而已確定為非 COPD的既往為吸煙者和/或現(xiàn)在為吸煙者的人群，他們的支氣管中的基底干細胞計數(shù)較低，并伴有氣流受限的臨床特征。這可能代表了COPD 的早期診斷前階段，表明基底干細胞衰竭與 COPD 發(fā)病機制有關(guān)[8-10]。

二、黏膜下支氣管干細胞的作用

人氣道黏膜下支氣管腺的導(dǎo)管細胞也同大氣道干細胞一樣通過在表面表達 CK5，CK14，p63 等而具備了干細胞的分化特性。有研究人員發(fā)現(xiàn)，將人黏膜下支氣管腺的導(dǎo)管細胞異種移植到大鼠氣管中會產(chǎn)生許多具有不同分化能力的細胞，包括腺細胞[11]。已有實驗?zāi)軌驈娜说臍夤苤蟹蛛x出這種導(dǎo)管腺干細胞(CD166+/CD44/NGFR)[12]，另外，Swatek AM等人從肺移植所致閉塞性細支氣管炎患者的尸檢肺標(biāo)本中獲得了與導(dǎo)管腺干細胞相似類型的細胞(p63+，CK5+，CK14+)，并發(fā)現(xiàn)這些干細胞的增殖能力隨著疾病的進展而下降，表明氣道黏膜下干細胞的衰竭可能是肺衰竭的一種機制[13]。這提示我們導(dǎo)管腺細胞或可在損傷的肺組織中起到修復(fù)作用，但目前尚未有學(xué)者在 COPD 和/或肺氣腫患者中對這類細胞進行相關(guān)研究。

三、支氣管肺泡干細胞的作用

在肺中，支氣管肺泡干細胞(BASCs)僅在支氣管肺泡導(dǎo)管連接處發(fā)現(xiàn)，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，但在肺損傷時會發(fā)生反應(yīng)性增殖。BASCs的細胞表面標(biāo)志物包括：2型肺泡上皮細胞表面活性劑蛋白C(SP-C)和波形蛋白[14]、血紅蛋白家族1A成員1(SCGB1A1)、干細胞抗原1(Sca-1)、CD34等。在體外將BASCs與來自人體肺內(nèi)的成纖維細胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)再生出了新的支氣管肺泡結(jié)構(gòu)[14]。肺的遠端氣道壁中也存在干細胞，將其移植到小鼠的受損肺中，表現(xiàn)出自我更新能力，分化出了內(nèi)胚層來源(上皮細胞)和中胚層來源(血管)的結(jié)構(gòu)，并進一步產(chǎn)生了人細支氣管、肺泡、血管等組織結(jié)構(gòu)，并部分恢復(fù)了小鼠的肺實質(zhì)[2]，雖然這類干細胞能夠修復(fù)小鼠受損肺組織，但目前尚未有關(guān)于在COPD患者中的臨床研究。

四、肺泡干細胞的作用

研究人員在小鼠模型實驗中發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮2型細胞(AT2)表面能夠表達axin-2(這是一種調(diào)節(jié)Wnt信號通路中β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定性的蛋白，具有調(diào)節(jié)干細胞的自我更新和譜系特異性分化的作用)，并顯示出了和干細胞相同的特征[15-17]，包括自我更新能力和分化為肺泡1型細胞(AT1 細胞)的能力[16]。另外，在AT2細胞表面還可發(fā)現(xiàn)上皮細胞粘附分子、足突細胞面膜蛋白(podoplanin，一種屬于黏蛋白型蛋白的小膜糖蛋白，是肺發(fā)育特別是肺泡型成熟所必需的)等。敲除小鼠端粒酶后，AT2細胞減少，隨之出現(xiàn)肺泡數(shù)目減少[18]，這提示AT2與肺泡的生成息息相關(guān)。肺組織中存在一種常駐肺泡干細胞，能夠表達類似于人間充質(zhì)干細胞(hMSCs)細胞表面標(biāo)志物，并且在體外具有克隆能力，可以分化為AT2細胞，這些細胞僅位于肺泡壁中。在體外實驗中，經(jīng)全反式維甲酸處理的人肺泡上皮干細胞，可以進一步分化為AT1和AT2 細胞，用Am80(合成類維生素A)刺激人的肺泡干細胞也促進了其分化[19]。另外發(fā)現(xiàn)磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶 B(Akt)途徑也參與了人肺泡干細胞的分化，主要作用機制是通過生長因子的作用進而促進細胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予相應(yīng)的抑制劑，阻斷Akt磷酸化的PI3K 途徑時，可以誘導(dǎo)肺泡上皮干細胞分化為AT1和AT2細胞[20]。此外，在由彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫的小鼠模型中，肺的Akt 磷酸化增強，使用PI3K抑制劑會導(dǎo)致肺泡干細胞分化[21]。

五、 肺組織間充質(zhì)干細胞的作用

肺組織中存在間充質(zhì)干細胞，其分泌的FGF-10(成纖維細胞生長因子10)，可以調(diào)節(jié)發(fā)育中的肺細胞分化所必需的 BMP、Wnt 和Shh信號途徑，研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)時，給予堿性成纖維細胞因子(bFGF) 或肝細胞生長因子(HGF)，肺間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出了一定的克隆性[22]。在同一環(huán)境內(nèi)進行培養(yǎng)時，肺間充質(zhì)干細胞還能夠促進氣道上皮干細胞的增殖和分化。這些特性或可應(yīng)用于COPD的治療，但尚未有相關(guān)臨床研究。

外源性干細胞種群的作用

目前有部分學(xué)者對外源性間充質(zhì)干細胞(骨髓間充質(zhì)干細胞、羊水間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞等)治療COPD的有效性進行了深入的研究[23-25]。臨床前研究表明，間充質(zhì)干細胞(MSCs)可以通過抗炎，免疫調(diào)節(jié)，旁分泌和組織修復(fù)作用以及促進內(nèi)源性干細胞增殖等途徑參與糾正COPD造成的肺損傷。

一、 抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用

人們對MSCs的抗炎作用在體外進行了廣泛研究[26]。這些研究包括MSCs對先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細胞的影響，以及對蛋白酶和蛋白酶抑制劑之間平衡的調(diào)節(jié)。MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用包括抑制T細胞和B細胞增殖，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細胞和T細胞并使單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞更傾向于表現(xiàn)為抗炎和耐受性表型。主要作用機制包括以下三種：(1)細胞之間的直接接觸(例如通過 MSCs和T細胞相互作用的程序性死亡-1)(2)可以表達吲哚胺2，3-雙加氧酶和促炎性介質(zhì)環(huán)氧合酶2(COX2)，進而介導(dǎo)前列腺素 E2(PGE2)引起氨基酸和脂質(zhì)代謝發(fā)生改變。(3)能夠產(chǎn)生PGE2和分泌因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和肝細胞生長因子。最近的數(shù)據(jù)表明，巨噬細胞吞噬凋亡的MSCs，并隨后極化為另一種巨噬細胞表型，有助于其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[27-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有誘導(dǎo)彈性蛋白酶處理的肺上皮細胞分泌白細胞蛋白酶抑制劑的作用，從而使上皮細胞分泌表皮生長因子(EGF)和HGF。蛋白酶抑制劑能夠阻斷蛋白酶介導(dǎo)的組織損傷，降低保護性介質(zhì)的降解。使用香煙煙霧提取物(CSE)對巨噬細胞進行處理，把處理后的巨噬細胞與MSCs進行共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs增加了巨噬細胞的活力并降低COX2，白介素(IL)-6等炎癥相關(guān)物質(zhì)的表達，并分泌誘導(dǎo)了抗炎細胞因子 IL-10[29]。總體而言，MSCs的這些特性可能對COPD有益。

二、 抗菌作用

MSCs不但具有抗炎作用而且能夠抗微生物[30]。其中包括通過激活其他炎癥細胞分泌免疫介質(zhì)以間接發(fā)揮作用，以及直接抑制作用。有實驗表明，在MSCs和MSCs衍生的條件培養(yǎng)基中，常見的幾種呼吸道病原體(如銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等)的生長速率和存活率明顯降低，可能是由于MSCs能夠分泌抗菌肽和免疫介質(zhì)(例如 IL-6，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，IL-8和巨噬細胞遷移抑制因子)[30]。這些因子能夠促使中性粒細胞聚集并提高中性粒細胞的抗菌活性。因此，MSCs的直接和間接作用都可能有助于宿主對入侵病原體的防御反應(yīng)，這可能與預(yù)防或治療 COPD 急性加重有關(guān)。

三、 旁分泌效應(yīng)

MSCs經(jīng)旁分泌途徑，參與調(diào)解生長因子的分泌，進而影響肺組織細胞及血管內(nèi)皮細胞等的再生[31]。 有研究表明給予COPD患者MSCs治療后，其體內(nèi)的HGF，EGF，VEGF等的mRNA 表達與對照組相比有所增加，損傷肺內(nèi)出現(xiàn)了組織再生和修復(fù)[32-36]。這些生長因子被認為有助于肺組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，而HGF的特異性與MSCs的抗凋亡作用有關(guān)[31]。以上作用機制對治療COPD具有指導(dǎo)意義。

四、 肺組織修復(fù)作用

肺氣腫的組織破壞的特征是肺泡附著的喪失，而MSCs治療可以恢復(fù)肺氣腫動物模型中受損的肺泡結(jié)構(gòu)。因此，我們提出MSCs在上皮細胞中的植入和轉(zhuǎn)分化有助于肺氣腫中破壞的肺結(jié)構(gòu)的重建。有動物研究發(fā)現(xiàn)MSCs 在給藥后 24 h之內(nèi)移入肺組織，但其數(shù)量似乎很少并隨時間的延長而逐漸減少[28]。盡管 MSCs的移入和保留可以增加肺損傷部位的MSCs，但實驗結(jié)果并沒有直接證明移入的MSCs參與了肺組織的修復(fù)。目前尚缺乏MSCs 對毀損性肺部結(jié)構(gòu)重建的直接證據(jù)。但有研究表明MSCs 移植可以通過促進香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD 小鼠內(nèi)源性肺干細胞的增殖來修復(fù)肺損傷[25]。

臨床應(yīng)用及展望

雖然我們對內(nèi)源性干細胞的作用機制有了一定的了解，但更詳細的作用機制尚不明確，且這些內(nèi)源性干細胞分化程度更高，是否有更好的干預(yù)方式可以激活其活性，促進他們向受損的肺組織分化，仍需進一步研究。另外，內(nèi)源性干細胞還不易被分離獲取，為相關(guān)實驗研究帶了巨大的挑戰(zhàn)，若應(yīng)用于臨床治療COPD尚存在局限性。與之相比，外源性干細胞作用機制相對明確，易于獲取，實驗技術(shù)相對成熟，且已有臨床研究證明間充質(zhì)干細胞不僅能夠安全有效的用于COPD 的治療，還明顯提高了患者的生存質(zhì)量，減少了病程中嚴重或致命的不良事件的發(fā)生[36-38]。雖然目前干細胞治療COPD的臨床研究還較少，仍有很多難題亟待解決，但干細胞獨特的生理特性及作用機制，為COPD的治療帶來新曙光，有望降低其高死亡率。