常利芳，白建榮，李銳，閆蕾，郝曜山，楊瑞娟，康晨

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

在植物分子生物學(xué)研究中，目的基因或啟動(dòng)子的功能研究都必須通過轉(zhuǎn)基因植物純系鑒定和分析。因此，從大量的轉(zhuǎn)化后代個(gè)體中獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)化植株是進(jìn)行這些研究的前提。用傳統(tǒng)方法篩選理想的轉(zhuǎn)化體及純系需要耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力，而應(yīng)用報(bào)告基因則可以提高轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)的效率[1-2]。報(bào)告基因（reporter gene）通常是指應(yīng)用編碼催化人工底物產(chǎn)生顏色變化，且表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測(cè)的基因。目前，轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)常用的報(bào)告基因有熒光素酶基因（LUC）、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）和綠色熒光蛋白基因（GFP）等[1-3]。這些報(bào)告基因系統(tǒng)中，GUS基因是通過離體染色進(jìn)行鑒定，雖然成本低，但步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度差，而且植物中存在內(nèi)源GUS和GUS抑制子[4]。GFP和LUC基因都是通過檢測(cè)生物體中的熒光信號(hào)檢測(cè)目的基因，但GFP基因在檢測(cè)時(shí)需要激發(fā)光，雖然靈敏度高，但是信噪比低，所以，檢出效率低[3，5-8]。螢火蟲熒光素酶基因是從螢火蟲中分離出來的發(fā)光基因，該基因產(chǎn)生的熒光素酶與底物結(jié)合后產(chǎn)生酶促反應(yīng)，本身可以產(chǎn)生熒光，不需要激發(fā)光，具有其他報(bào)告基因不可替代的優(yōu)勢(shì)，即快速簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、無毒無放射性、靈敏度高、信噪比高等。自1986年起，螢火蟲熒光素酶基因被用作測(cè)定基因表達(dá)的報(bào)告基因，成為高效檢測(cè)基因表達(dá)和啟動(dòng)子的常用方法[9-16]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在不破壞生物體組織的前提下，采用活體成像技術(shù)檢測(cè)生物體的熒光信號(hào)，具有操作簡(jiǎn)單、直觀、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及藥物研發(fā)等方面[17-18]，但是作為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的手段的應(yīng)用研究還比較少[16，19-20]，目前還沒有見熒光素酶基因作為報(bào)告基因在主要糧食作物轉(zhuǎn)基因植株鑒定中的應(yīng)用。

本研究利用植物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)玉米轉(zhuǎn)基因植株的熒光素酶基因信號(hào)，建立和優(yōu)化整株轉(zhuǎn)基因植株的熒光素酶活體檢測(cè)體系，為玉米轉(zhuǎn)基因后代植株的篩選鑒定提供簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、低成本的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為玉米自交系鄭58和以鄭58為受體的熒光素酶轉(zhuǎn)基因T1種子，均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保存。包括2017年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽日光溫室采用花粉管轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化玉米受體鄭58，共獲得轉(zhuǎn)化35S-Luciferase-NOS的T1種子66粒；轉(zhuǎn)化Ubiquitin-Luciferase-NOS的種子68粒。D-螢火蟲熒光素酶底物購(gòu)自北京融京科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器

德國(guó)Berthold公司生產(chǎn)的植物活體成像系統(tǒng)Night SHADE LB 985采用儀器自帶的IndiGo軟件進(jìn)行圖像處理及分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植株培養(yǎng)2018年6月，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分子生物共享實(shí)驗(yàn)室，以玉米自交系鄭58作為對(duì)照，與T1轉(zhuǎn)基因種子一起消毒清洗后，單粒種于裝有10 mL MS培養(yǎng)基的50 mL離心管中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.3.2 活體成像系統(tǒng)檢測(cè)參數(shù)的設(shè)置將培養(yǎng)好的植株幼芽取出，用清水洗去根部的培養(yǎng)基，將幼芽放在加了碳素墨水的黑色瓊脂糖凝膠平板上，噴施15 mg/mL D-熒光素酶底物，放入Night SHADE LB985植物活體成像系統(tǒng)暗箱平臺(tái)，靜置反應(yīng)2 min后，打開IndiGo軟件設(shè)定不同的拍照參數(shù)，拍照比較曝光時(shí)間2 min、像素合并值binning 4×4和曝光時(shí)間5 min、像素合并值binning 8×8的成像效果。

1.3.3 玉米植株的大小選擇設(shè)置3組大小的玉米植株，第1組：玉米幼芽小于1 cm；第2組：玉米幼芽3～8 cm；第3組：兩葉期的玉米幼苗。

1.3.4 成像信噪比值以植株熒光最高點(diǎn)的信號(hào)值作為該株的信號(hào)值，待測(cè)植株信號(hào)值與對(duì)照植株信號(hào)值均減去背景信號(hào)值后的比值作為信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）。

2 結(jié)果與分析

2.1 活體成像系統(tǒng)參數(shù)的確定

由圖1可知，在曝光時(shí)間2 min、像素合并值binning 4×4時(shí)，玉米幼芽的信號(hào)最高值為124 cps，而曝光時(shí)間5 min、像素合并值binning 8×8時(shí)，幼芽的信號(hào)值為1 736 cps，靈敏度更高，適合于玉米幼芽的檢測(cè)。

2.2 確定玉米植株的大小

在曝光時(shí)間5 min、像素合并值binning 8×8條件下，分別比較了玉米芽和兩葉期幼苗的熒光信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在芽長(zhǎng)小于1 cm時(shí)無法檢測(cè)到熒光信號(hào)；3～8 cm的幼芽可以檢測(cè)到明確的信號(hào)，最高值為936 cps；而兩葉期幼苗的背景信號(hào)過強(qiáng)，并且底物無法被葉片吸收，無法檢測(cè)到信號(hào)（圖2）。多次試驗(yàn)后，最終確定28℃恒溫發(fā)芽4～5 d、3～8 cm玉米幼芽用于活體系統(tǒng)檢測(cè)。

2.3 根據(jù)信噪比值鑒定轉(zhuǎn)基因玉米植株

按照2.1、2.2優(yōu)化后的條件對(duì)轉(zhuǎn)基因T1植株進(jìn)行檢測(cè)，初篩結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化35S-Luciferase-NOS發(fā)芽種子66株中，11株有熒光信號(hào)；轉(zhuǎn)化Ubiquitin-Luciferase-NOS的發(fā)芽種子68株中，30株有熒光信號(hào)。進(jìn)一步對(duì)這11株和30株分別進(jìn)行單株復(fù)檢，其中，35S-9和35S-10信噪比值均大于2.0，分別為2.32和2.56；UB-1、UB-6、UB-11、UB-13、UB-21、UB-27信噪比分別為9.75、10.63、5.69、11.00、5.06和3.81，均大于2.0，其他植株的信噪比都小于2.0，35S-10植株的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示?？梢哉J(rèn)為信噪比大于2.0的植株為強(qiáng)表達(dá)陽性植株。

3 結(jié)論與討論

螢火蟲熒光素酶基因（LUC）以不破壞植株、背景低、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)可作為高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的可視化標(biāo)記。熒光素酶在底物存在的條件下發(fā)生酶促反應(yīng)，但前人多使用熒光檢測(cè)儀、熒光光子計(jì)數(shù)器通過體外細(xì)胞或組織發(fā)出熒光的相對(duì)熒光光子數(shù)來分析熒光素酶基因的表達(dá)情況，操作復(fù)雜，而且大量的人為操作使精確性降低[13-15]。有研究者用熒光成像儀檢測(cè)帶有熒光素酶基因的擬南芥的功能，但是只是用白光和熒光下的對(duì)比進(jìn)行定性判斷，用色標(biāo)度的顏色反映基因表達(dá)的強(qiáng)弱[19-20]。也有用色標(biāo)度簡(jiǎn)單地將有信號(hào)的植株分為無、弱、中等、強(qiáng)和較強(qiáng)5個(gè)級(jí)別進(jìn)行定量分級(jí)的報(bào)道[16]。本研究表明，在曝光時(shí)間5 min、像素合并值binning 8×8條件下，以培養(yǎng)3～8 cm的玉米幼芽為材料，能夠較好的檢測(cè)到植株熒光素酶信號(hào)。同時(shí)，為了更加準(zhǔn)確的判斷陽性植株，本研究引入信噪比的概念進(jìn)行定量檢測(cè)，將待測(cè)植株與對(duì)照同時(shí)拍照，將二者的信號(hào)峰值分別減去背景值后的比值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，并確定信噪比值大于2.0的植株為強(qiáng)表達(dá)陽性植株。該優(yōu)化的檢測(cè)體系降低了檢測(cè)的假陽性和外源基因表達(dá)較弱的植株，能夠更加準(zhǔn)確、直觀、快速和有效的篩選玉米遺傳轉(zhuǎn)化中的陽性植株，提高轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定效率。