盛望，王瑾茜，殷淑婷,2，李旭華，胡國(guó)恒,2，謝麗華,2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以認(rèn)知障礙、行為異常、神經(jīng)精神癥狀為主要臨床表現(xiàn)的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。世界阿爾茨海默病2018年報(bào)告全球約有5 000萬(wàn)人患有癡呆，且患病人數(shù)將逐年上升，預(yù)計(jì)至2050年，患病人數(shù)將增至1.52億;而全球社會(huì)與該疾病相關(guān)的治療費(fèi)用每年約1萬(wàn)億美元，預(yù)計(jì)到2030年將翻一倍[1]。其病因病機(jī)復(fù)雜且尚不明確，現(xiàn)代研究表明，年齡、性別、遺傳因素等為AD的主要發(fā)病原因[2]，其發(fā)病機(jī)制假說(shuō)主要有基因遺傳學(xué)說(shuō)、膽堿能學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、Aβ淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)、炎癥和免疫學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、Tau蛋白異常磷酸化假說(shuō)等[3-4]。目前治療手段以改善臨床癥狀為主，臨床主要予以膽堿酶抑制劑(ChEI)、N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑、淀粉樣前體蛋白B位點(diǎn)分裂酶(BACE)抑制劑等改善患者認(rèn)知功能，但不能有效的逆轉(zhuǎn)或阻止病情進(jìn)展[4]。因此探尋或開(kāi)發(fā)能有效防治AD的藥物研究具有重要意義。人參“補(bǔ)氣，固脫，生津，安神，益智”[5]，人參皂苷Rg1是人參的主要藥效成分之一，陳紅淑等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可通過(guò)有效提高細(xì)胞活力，抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)，從而抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬性死亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。李乃靜等[7]研究表明，人參皂苷Rg1不僅可減少AD小鼠海馬組織的Aβ沉積，改善AD小鼠的認(rèn)知功能，還可通過(guò)影響次黃嘌呤、二氫鞘胺醇、十六碳黃嘌呤等水平調(diào)節(jié)腦代謝，以防治AD?？梢?jiàn)，人參皂苷Rg1在防治AD方面具有重要的研究?jī)r(jià)值。

本研究通過(guò)對(duì)人參皂苷Rg1作用靶點(diǎn)和AD相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行篩選匯總，得出人參皂苷Rg1作用于AD的作用交聯(lián)靶點(diǎn)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，從靶點(diǎn)、信號(hào)通路的角度研究人參皂苷Rg1治療AD的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明其治療AD的藥理作用及機(jī)制提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 人參皂苷Rg1作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查找人參皂苷Rg1化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并保存其mol2格式文件。將TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的人參皂苷Rg1分子結(jié)構(gòu)以mol2格式輸入PharmMapper Server平臺(tái)(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，設(shè)置人類(lèi)蛋白靶點(diǎn)作為藥效團(tuán)映射，并設(shè)定返回靶點(diǎn)數(shù)為300，得到人參皂苷Rg1相關(guān)的靶點(diǎn)名稱、基因名稱、Uniprot ID、匹配值(fit score)等結(jié)果，錄入U(xiǎn)niprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，選擇物種為“Homo sapiens”，刪除重復(fù)、非人源與不規(guī)范的靶點(diǎn)，校正為其官方名稱并摘錄其標(biāo)準(zhǔn)基因名，最終得到人參皂苷Rg1活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 人參皂苷Rg1作用靶點(diǎn)蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.1預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)，限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用域值設(shè)為highest confidence≥0.9，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，從而獲得蛋白互作信息。將從STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出的文件中node1、node2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析，使用Network Analyzer功能對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)面積大小及顏色深淺代表度(Degree)值的大小，并得到網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。

1.3 人參皂苷Rg1作用AD相關(guān)靶點(diǎn)的收集及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)”作為檢索詞，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ctdbase.org/)查找與AD相關(guān)靶點(diǎn)，每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇相關(guān)度前300的靶點(diǎn)作為慢性胃炎疾病靶點(diǎn)進(jìn)行研究，合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，去除重復(fù)基因和假陽(yáng)性基因，將所得AD相關(guān)靶點(diǎn)與人參皂苷Rg1活性成分作用靶點(diǎn)通過(guò)VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)得出共同靶點(diǎn)，即為人參皂苷Rg1治療AD的作用靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用域值設(shè)為highest confidence≥0.4，獲得靶點(diǎn)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖，將該圖進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 人參皂苷Rg1作用AD的GO富集分析與通路注釋分析

將人參皂苷Rg1治療AD的作用靶點(diǎn)以Gene Symbol的格式導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，分別選擇生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function, MF)和細(xì)胞成分(cellular component, CC)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，選擇KEGG進(jìn)行靶點(diǎn)基因通路注釋分析，并且使用GraphPad Prism 8軟件將GO富集分析滿足PValue<0.05的結(jié)果做成可視化條形圖。使用Omicshare(https://www.omicshare.com/)將KEGG分析滿足PValue<0.05的結(jié)果制成可視化氣泡圖。

1.5 人參皂苷Rg1與其作用AD靶點(diǎn)之間分子對(duì)接驗(yàn)證

利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)查找篩選出的45個(gè)靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，利用ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zinc.docking.org/)查找篩選出的人參皂苷Rg1的Mol2結(jié)構(gòu)式，將活性成分的Mol2結(jié)構(gòu)式與PDB ID形式的靶點(diǎn)導(dǎo)入AutoDock軟件，對(duì)活性成分和靶標(biāo)蛋白進(jìn)行虛擬分子對(duì)接分析。結(jié)合能小于0說(shuō)明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，目前對(duì)活性分子篩選尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，這里選取結(jié)合能≤-5kJ/mol的成分作為人參皂苷Rg1治療AD的有效成分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1潛在靶點(diǎn)信息

根據(jù)PharmMapper Server數(shù)據(jù)庫(kù)查找人參皂苷Rg1靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)及經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)校正后得到潛在靶點(diǎn)284個(gè)及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的基因名，其中highest confidence≥0.9靶點(diǎn)有203個(gè)。人參皂苷Rg1靶點(diǎn)相互作用見(jiàn)圖1，其中，節(jié)點(diǎn)顏色越深對(duì)應(yīng)面積越大，代表度值越大。度值表示該靶點(diǎn)與其他作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，度值越大表明該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要，度值排名前10的靶點(diǎn)分別為MAPK1、SRC、PIK3R1、AKT1、RXRA、HRAS、GRB2、MAPK14、PTPN11、HSP90AA1，且均可作用于20個(gè)以上的靶點(diǎn)，說(shuō)明這些靶點(diǎn)在人參皂苷Rg1作用網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)詳細(xì)信息見(jiàn)表1(僅列靶點(diǎn)度值的前30個(gè)靶點(diǎn))。

表1 人參皂苷Rg1蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析(度值排序前30個(gè)靶點(diǎn))

圖1 人參皂苷Rg1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.2 AD相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及對(duì)比分析

在GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選31 274個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)相關(guān)度每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)取前300個(gè)靶點(diǎn)組建AD相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，VENNY2.1軟件從AD相關(guān)靶點(diǎn)與人參皂苷Rg1作用靶點(diǎn)兩組數(shù)據(jù)中共得到45個(gè)共同靶點(diǎn)作為人參皂苷Rg1治療AD的作用靶點(diǎn)。人參皂苷Rg1與AD相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)韋恩圖，見(jiàn)圖2。人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見(jiàn)圖3。人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析，見(jiàn)表2。經(jīng)Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)屬性發(fā)現(xiàn)，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中聚類(lèi)系數(shù)為0.683，平均節(jié)點(diǎn)度為17.644，平均最短路徑1.07～2.23，介數(shù)中心性在0～0.13。該45個(gè)共同靶點(diǎn)是人參皂苷Rg1與疾病作用的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，并在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)了較好的聯(lián)通特性。其中，ALB、AKT1、MAPK1、CASP3、EGFR、MAPK8、MMP9、HSP90AA1、SRC、ESR1、MAPK14均可與25個(gè)及以上靶點(diǎn)相互聯(lián)系，提示這些靶點(diǎn)可能是人參皂苷Rg1治療AD的重要靶點(diǎn)。

表2 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析

圖2 人參皂苷Rg1靶點(diǎn)與AD相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.3 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的GO富集分析與通路注釋分析

根據(jù)1.4中的分析方法，GO富集分析在生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分三個(gè)方面，分別得到42個(gè)條目，24個(gè)條目，14個(gè)條目，分別取前10個(gè)條目做成可視化條形圖，如圖4。KEGG通路注釋分析共分析出78條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將前20條通路做成可視化氣泡圖，如圖5，其中涉及10條通路與AD相關(guān)，分別是Estrogen signaling pathway(雌激素信號(hào)通路)、Prolactin signaling pathway(催乳素信號(hào)通路)、ErbB signaling pathway(跨膜酪氨酸激酶信號(hào)通路)、FoxO signaling pathway(FoxO信號(hào)通路)、TNF signaling pathway(腫瘤壞死因子信號(hào)通路)、GnRH signaling pathway(促性腺激素釋放激素信號(hào)通路)、HIF-1 signaling pathway(缺氧誘導(dǎo)因子-1)、VEGF signaling pathway(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路)、PPAR signaling pathway(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路)、Insulin resistance(胰島素抵抗)。

圖4 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的GO富集分析

圖5 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的KEGG分析氣泡圖

3 分子對(duì)接結(jié)果

應(yīng)用AutoDock軟件對(duì)篩選出的人參皂苷Rg1與其作用AD的45個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，一般認(rèn)為配體與受體的結(jié)合能越低，其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生的作用可能性越大，本研究中，與人參皂苷Rg1結(jié)合能最低的蛋白分別為CTSB(結(jié)合能為-38.53 kJ/mol)、BCHE(結(jié)合能為-33.47 kJ/mol)、AKT1(結(jié)合能為-28.16 kJ/mol)。以-5 kJ/mol為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，可知人參皂苷Rg1與CTSB、BCHE、AKT1、MMP3、EGFR、IL2、TTR、CTSD、NQO1、PPARG等41個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，提示人參皂苷Rg1與預(yù)測(cè)的AD作用靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。具體見(jiàn)表3，人參皂苷Rg1與結(jié)合能前6靶點(diǎn)的結(jié)合模式見(jiàn)圖6。

表3 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

圖6 人參皂苷Rg1與部分靶點(diǎn)分子對(duì)接模式

4 討論

根據(jù)圖1人參皂苷Rg1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，通過(guò)篩選后得到284個(gè)人參皂苷Rg1潛在的靶點(diǎn)，其中highest confidence≥0.9靶點(diǎn)有203個(gè)，圖3顯示人參皂苷Rg1作用AD的靶點(diǎn)有45個(gè)。根據(jù)圖4人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞自噬相關(guān)的靶點(diǎn)有PPARG、STAT1、PPARA，其中，PPARA/α 是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的一種轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝，Rongcan Luo等[9]研究發(fā)現(xiàn)PPARA激動(dòng)劑有助于降低阿爾茨海默病模型小鼠海馬和皮質(zhì)組織中的β-淀粉樣蛋白(Aβ)水平，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞向Aβ斑塊附近募集以增強(qiáng)自噬反應(yīng)，改善小鼠記憶力和焦慮癥狀。與血脂調(diào)節(jié)有關(guān)的靶點(diǎn)包括ESR1、NR3C1、NR1H3、PPARA、PPARG，Avik Roy等[10]通過(guò)他汀類(lèi)藥物與PPARA配體結(jié)合域結(jié)合后發(fā)現(xiàn)可激活PPARA介導(dǎo)的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的轉(zhuǎn)錄，以增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，改善阿爾茨海默病模型小鼠的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能及記憶力。與tau蛋白過(guò)度磷酸化相關(guān)的靶點(diǎn)有MAPK1、MAPK14、GSK3B，絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物過(guò)程[11]，p38MAPK的定位和激活與tau磷酸化呈正相關(guān)，其抑制作用是通過(guò)抑制p38抑制神經(jīng)元細(xì)胞中的Tau病理學(xué)、降低Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的化合物以對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的p38MAPK途徑減少神經(jīng)炎癥、抑制p38改善神經(jīng)突觸可塑性等途徑減輕AD癥狀[12]。此外，通過(guò)GO富集分析可知，與腦代謝有關(guān)的靶點(diǎn)包括MMP9、CTSB、MMP2、MMP13、MMP1，與炎性反應(yīng)有關(guān)的靶點(diǎn)有PPARA、IL2、NR1H3，與氧化應(yīng)激有關(guān)的靶點(diǎn)NOS3、SOD2、NOS2，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶點(diǎn)有IGF1R、CASP3、ALB、GSK3B、MMP9、SRC，與晝夜節(jié)律性相關(guān)的靶點(diǎn)有PPARA、PPARG、GSK3B、NOS2。

如圖5所示，對(duì)人參皂苷Rg1作用AD的45個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路注釋分析。得到10條通路與AD相關(guān)。雌激素為一種性激素，已有研究表明，機(jī)體內(nèi)雌激素水平與AD的發(fā)病率有明顯有關(guān)[13]。雌激素可通過(guò)調(diào)控ERs轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少Aβ生成，增加Aβ降解、抑制tau蛋白累積及異常磷酸化或激活MAPK信號(hào)通路等途徑發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，在防治AD方面具有一定前景[14]。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ三種亞型組成，是調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，Lourenco等研究表明， PPARγ激活后可直接與類(lèi)視黃醇X受體(RXR)結(jié)合促進(jìn)RXR蛋白的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能，增強(qiáng)對(duì)Aβ的吸收，亦可調(diào)節(jié)PPAR基因表達(dá)激活ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吸收Aβ，此外，還可通過(guò)提高胰島素敏感性，減輕炎癥反應(yīng)等途徑改善AD認(rèn)知功能[15]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)元的作用，廣泛參與在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程[16]。研究表明，VEGF可通過(guò)促進(jìn)血管生成、保護(hù)血管完整性以抑制Aβ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而改善AD模型的記憶行為[17]。此外，VEGF還可通過(guò)關(guān)聯(lián)PI3K/AKT信號(hào)通路、HIF-1α、FoxO3a等途徑抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、抑制tau蛋白過(guò)度磷酸化、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元[18]。VEGF信號(hào)通路與ErbB信號(hào)通路相互交叉，屬VEGF超家族家員之一的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(Nrg1)可通過(guò)與ErbB蛋白受體酪氨酸激酶結(jié)合進(jìn)行多種生物學(xué)過(guò)程。上調(diào)Nrg1-ErbB信號(hào)通路可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、減輕細(xì)胞凋亡、抵抗Aβ的積累等途徑在AD的發(fā)病過(guò)程中起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[19]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)人參皂苷Rg1在治療AD的作用機(jī)制進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可能通過(guò)作用于CTSB、BCHE、AKT1、MMP3、EGFR、IL2等45個(gè)與AD相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、保護(hù)神經(jīng)元、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抑制細(xì)胞凋亡、減少炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、改善腦代謝等多種途徑以減少Aβ的積累、抑制tau蛋白累積及異常磷酸化、減輕內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元損傷發(fā)揮改善AD癥狀的作用。而分子對(duì)接結(jié)果提示人參皂苷Rg1與其作用AD的靶點(diǎn)結(jié)合活性較好，為本研究預(yù)測(cè)的真實(shí)性提供科學(xué)依據(jù)。