安歡，葉云，丁華杰，朱云婷，鐘英英

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006)

苦瓜(MomordicacharantiaL.) 是一種藥食兩用的植物，其營養(yǎng)價值豐富，具有清熱解毒、養(yǎng)顏嫩膚和降血糖等功效，而苦瓜作為一種天然的“苦”味覺調(diào)味品，不僅可以作為日常食用瓜果，苦瓜粗提取物也含有類似胰島素物質(zhì)，具有明顯的降血糖功效。且其降血糖、抗腫瘤及增強免疫活性等功效引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1]。

目前，肥胖已經(jīng)成為全球性的健康問題。研究表明，肥胖的特征在于脂肪量的增加，脂肪組織功能發(fā)生障礙的原因是脂肪細(xì)胞的增生和肥大[2]。抑制體內(nèi)胰脂肪酶活性可有效地抑制脂肪儲存，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞增殖、分化和新陳代謝。因此，胰脂肪酶抑制劑的研究受到了科研工作者的廣泛關(guān)注[3]。本研究探討了苦瓜多糖對胰脂肪酶活性抑制作用的影響，通過酶動力學(xué)分析考察其對胰脂肪酶抑制類型，為苦瓜的綜合利用提供了新的途徑。

1 材料

苦瓜：購自廣西柳州冠超市，切片、烘干、粉碎后過40目標(biāo)準(zhǔn)篩得到苦瓜粉末。胰脂肪酶(活力≥30000 U/g)：上海源葉生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、鄰苯二甲酸氫鉀：廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究中心；三油酸甘油酯：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇等其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 苦瓜多糖的提取

根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-6]稍作修改，采用熱水浸提法來提取苦瓜多糖：苦瓜粉末用80%乙醇回流浸提2次，每次2 h，除去雜質(zhì)，真空抽濾回收乙醇，濾渣烘干待用。稱取 10.000 g預(yù)處理的苦瓜粉末，90 ℃水浴加熱按照料液比為 1∶20回流4 h，趁熱抽濾后合并濾液。苦瓜多糖浸提液真空濃縮至原體積的1/5，加入 5倍體積的 80%乙醇進行醇沉 12 h 析出多糖，醇沉液離心后洗滌濾餅，40 ℃條件下干燥至恒重后得到的固體即為苦瓜粗多糖。

2.2 苦瓜多糖含量的測定

用紫外分光光度計在340～600 nm 范圍內(nèi)進行掃描，確定苦瓜多糖的最大吸收波長[7]。在最大吸收波長處分別測出不同濃度的葡萄糖溶液的吸光度。利用葡萄糖濃度(mg/mL)對吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程[8]。測定樣品吸光度，根據(jù)吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出苦瓜多糖含量。

2.3 胰脂肪酶活性試驗

參照褚盼盼等[9]的研究方法，對胰脂肪酶的活性進行檢測，平行試驗3次，空白試驗除了加入95%乙醇和加入酶液兩個步驟相互調(diào)換之后，其他步驟同上[10]。

胰脂肪酶活力(UI)=1000×(V樣-V空)×c/tw 。

式中：c為NaOH溶液的濃度，mol/L；w為胰脂肪酶取樣量，g；t為反應(yīng)時間，min。

2.4 不同反應(yīng)條件下苦瓜多糖對胰脂肪酶活力抑制影響

2.4.1 不同濃度的苦瓜多糖對胰脂肪酶活性的抑制

配制5份濃度分別為10，20，30，40，50 mg/mL的苦瓜多糖溶液，分別吸取5 mL放于不同錐形瓶中，按照測定胰脂肪酶活性試驗的方法，求出不同濃度的苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率[11]。

2.4.2 不同 pH 對胰脂肪酶活性的抑制

結(jié)合2.4.1的試驗結(jié)果，對苦瓜多糖抑制率達(dá)到最大濃度條件，配制pH為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的5組磷酸緩沖液，計算不同pH的苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率。

2.4.3 不同反應(yīng)時間對胰脂肪酶活性的抑制

設(shè)定5個不同的反應(yīng)時間分別為5，15，25，35，45 min，結(jié)合2.4.1和2.4.2兩個步驟，選擇最佳苦瓜多糖濃度和最適pH，計算不同反應(yīng)時間的苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率。

2.4.4 不同溫度對胰脂肪酶活性的抑制

設(shè)置5個不同的反應(yīng)溫度20，25，37，50，60 ℃，結(jié)合2.4.1、2.4.2和2.4.3 3個步驟得出的試驗結(jié)果，在最佳苦瓜多糖濃度、反應(yīng)時間，最適pH的條件下，按照測定胰脂肪酶活性試驗的方法，求出不同反應(yīng)溫度的苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率。

2.5 半抑制濃度IC50的測定

按照胰脂肪酶活性試驗，得出最佳反應(yīng)條件，即磷酸緩沖液pH為7.5，反應(yīng)時間為15 min，反應(yīng)溫度為37 ℃，以此條件測定不同濃度的苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率，繪制回歸曲線，得出半抑制濃度IC50[12]。

2.6 抑制作用類型的測定

選擇胰脂肪酶最佳抑制率條件，為檢測苦瓜多糖在10，20，30，40，50 mg/mL的濃度時對脂肪的分解速度。采用2組檢測液，每組的聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液添加量各不同。并且以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，苦瓜多糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制Dixon圖，求出苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制常數(shù)Ki[13]。比較不同濃度底物的反應(yīng)對苦瓜多糖含量的影響，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)模型進行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦瓜多糖含量的測定

3.1.1 最大吸收波長

圖1 苦瓜多糖在不同波長處吸光度曲線圖Fig.1 Absorbance curve of Momordica charantia polysaccharide at different wavelengths

由圖1可知，波長在 340～440 nm時，吸光度值曲線處于較平緩狀態(tài)，當(dāng)波長繼續(xù)增大時吸光度值出現(xiàn)大幅度的上升趨勢，當(dāng)波長處于487 nm時，苦瓜多糖的吸光度值最大，因此苦瓜多糖的最大吸收波長為487 nm。

3.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

圖2 葡萄糖在不同波長處吸光度曲線圖Fig.2 Absorbance curve of glucose at different wavelengths

由圖2可知，當(dāng)波長為487 nm時葡萄糖的吸光度值在特征光譜吸收中最為明顯，因此選擇在此波長下測定葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

由圖3可知，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖可得到回歸方程為y=0.2169x+0.2201，R2=0.9987，因此葡萄糖濃度在0.4～4.8 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.2 不同反應(yīng)條件下苦瓜多糖對胰脂肪酶活力的抑制特性研究

3.2.1 不同濃度的苦瓜多糖對胰脂肪酶活性的抑制

圖4 不同濃度的苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide with different concentration on pancreatic lipase

由圖4可知，苦瓜多糖濃度從10 mg/mL逐漸增加到50 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，脂肪酶受抑制作用隨著濃度增大越來越明顯，濃度達(dá)到30 mg/mL時抑制率達(dá)到最大值，為51.24%，繼續(xù)增大濃度，抑制率降低，因為此時苦瓜多糖與脂肪酶的結(jié)合達(dá)到飽和的狀態(tài)，酶促反應(yīng)速率降低。

3.2.2 不同pH的苦瓜多糖對胰脂肪酶活性的抑制

圖5 不同pH下苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase at different pH values

由圖5可知，不同的pH條件下苦瓜多糖對胰脂肪酶r 抑制作用有所不同， pH為5.5時抑制率最低，隨著pH的不斷增大，pH為7.5時抑制率達(dá)到最大，但隨后pH的增大抑制作用反而逐漸減弱。原因可能是胰脂肪酶在強酸強堿的條件下，酶的構(gòu)象易發(fā)生改變，導(dǎo)致其活性損失[14]。在中性略偏堿性時，酶活性最高，對胰脂肪酶的抑制率最大。動物體內(nèi)酶的最適pH一般在6.5～8.0范圍內(nèi)，酶的活性受pH影響，過酸過堿都會使酶蛋白變性失活，從而影響到脂肪的水解。

3.2.3 不同反應(yīng)時間的苦瓜多糖對胰脂肪酶活性的抑制

圖6 不同反應(yīng)時間下苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of Momordica charantia on polysaccharide pancreatic lipase at different reaction time

由圖6可知，反應(yīng)時間在2～15 min范圍內(nèi)，抑制率隨著反應(yīng)時間的延長不斷增高，說明苦瓜多糖與胰脂肪酶的結(jié)合需要一定時間，隨著時間的繼續(xù)延長，苦瓜多糖與胰脂肪酶結(jié)合達(dá)到飽和，抑制率隨之降低。也可能是苦瓜粗提物中含有的苦瓜蛋白能與酶蛋白作用生成生成物導(dǎo)致蛋白沉淀，降低酶活性，其相互作用隨著反應(yīng)時間的加長而不斷增加，使胰脂肪酶的活性降低。因此可以得出苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制的最佳反應(yīng)時間為15 min。

3.2.4 不同反應(yīng)溫度的苦瓜多糖對胰脂肪酶活性的抑制

圖7 不同反應(yīng)溫度下苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase at different reaction temperatures

由圖7可知，胰脂肪酶活性受溫度影響波動較明顯，當(dāng)溫度處于37 ℃時酶活力達(dá)到最大值45.6%。低溫會抑制酶的活性，相反，溫度過高，超過60 ℃時酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變從而變性，導(dǎo)致酶催化活力大幅度下降。胰脂肪酶一般都是從哺乳動物體內(nèi)提取，哺乳動物體內(nèi)正常溫度一般為37 ℃，得出37 ℃為苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用的臨界溫度。

3.3 半抑制濃度IC50的測定結(jié)果

圖8 最佳反應(yīng)條件下不同濃度苦瓜多糖 對胰脂肪酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of Momordica charantia polysaccharide with different concentration on pancreatic lipase under the optimum reaction conditions

由圖8可知，苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用的多項式方程為：y=-0.0463x2+3.3969x-11.202，R2=0.9865，故苦瓜多糖濃度為30 mg/mL時抑制率最佳，對胰脂肪酶抑制作用的半抑制濃度為29.86 mg/mL。雖然苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率并不高，但其半抑制濃度較高，原因可能是在苦瓜多糖濃度較低時，多糖與底物結(jié)合率也較低，胰脂肪酶對其靈敏性相對遲鈍。

3.4 抑制作用類型的測定結(jié)果

苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用的Dixon和Lineweaver-Burk圖見圖9和圖10。

圖9 苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用Dixon圖Fig.9 Dixon diagram of the inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase

由圖9可知，添加不同量底物時，不同濃度苦瓜多糖對其反應(yīng)速度的影響曲線交點的絕對值為21.62，胰脂肪酶的抑制常數(shù)Ki=21.62 mg/mL<50 mg/mL，得出苦瓜多糖對脂肪酶的抑制作用較強。

圖10 苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用Lineweaver-Burk圖Fig.10 Lineweaver-Burk diagram of the inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase

由圖10可知，改變底物濃度，樣品組加入苦瓜多糖，對照組不加苦瓜多糖，得到底物濃度倒數(shù)與反應(yīng)速度倒數(shù)曲線相交，符合非競爭性抑制的特征[15]。因此得出苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制作用是非競爭性抑制，底物濃度并不會影響苦瓜多糖與胰脂肪酶的結(jié)合率。

4 結(jié)論

苦瓜因其獨特的苦味常被用作一種調(diào)味品，因其豐富的營養(yǎng)價值受到人們的關(guān)注，在烹制某些食品時略加一點苦味調(diào)味品，會使菜肴有一種特殊的香鮮滋味，刺激人的食欲。

本文主要研究苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用的影響，在不同的反應(yīng)條件下測出苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率，并進一步分析其對胰脂肪酶的抑制類型及抑制常數(shù)。經(jīng)過試驗結(jié)果分析得出得苦瓜多糖的最大吸收波長為487 nm，吸光度最大，對胰脂肪酶的最佳抑制條件為：苦瓜多糖濃度為30 mg/mL，反應(yīng)時間為15 min，pH為7.5，反應(yīng)溫度37 ℃，該條件下苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制率達(dá)到51.24%。苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制類型測定結(jié)果顯示：苦瓜多糖對胰脂肪酶的抑制常數(shù)為21.62 mg/mL，抑制類型為非競爭性抑制，對胰脂肪酶的抑制作用明顯。苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用也受其他因素的影響，有待進一步研究。

在最佳抑制條件下測定結(jié)果表明，苦瓜多糖對胰脂肪酶有明顯的抑制作用，因此將苦瓜多糖開發(fā)為一種減肥藥物具有潛在的市場前景，此外，苦瓜多糖的抗菌、抗氧化和抗腫瘤等功效有待進一步的研究與應(yīng)用。