衡小成，毛祥，黃丹,2,3，顏琴玲，葉光斌,2*

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù) 及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；3.四川省川南曬制麩醋 生物釀造技術(shù)工作實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000)

傳統(tǒng)麩醋以麩皮為主要原料，糖化、酒化、醋化同池發(fā)酵，并采用翻醅、低溫、固態(tài)發(fā)酵，其過(guò)程是經(jīng)典的生料固態(tài)多菌混合發(fā)酵，產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特[1]。傳統(tǒng)麩醋工藝首先是制作醋母，將大米(糯米)浸泡，煮至沒有米芯，冷卻后加藥曲，中途每天攪拌，直到不冒泡，變酸即可使用。然后將醋母和麩皮按比例拌和后入池發(fā)酵，前期蓋上草席。入池發(fā)酵完成后裝壇曬醅。最后淋醋(套淋)、滅菌，即可裝瓶。與鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建紅曲醋相比[2-4]，傳統(tǒng)的麩醋是唯一的藥醋，藥曲在制作過(guò)程中添加了許多中藥，如川芎、母丁、五味子、白寇、蒼術(shù)、花丁等名貴藥材，使成品醋具有色澤黑褐、味道幽香、久存而不腐的品質(zhì)[5]，傳統(tǒng)麩醋都有長(zhǎng)時(shí)間的曬醅過(guò)程，原料經(jīng)過(guò)第一次入池發(fā)酵后，裝壇密封，再經(jīng)歷幾年的露天曬醅，從而形成麩醋極具特色的風(fēng)味。傳統(tǒng)麩醋糖化、酒化、醋化在一池內(nèi)各個(gè)階段都有發(fā)生，生成的糖類物質(zhì)可迅速轉(zhuǎn)化為乙醇，而生成的乙醇等物質(zhì)在微生物的作用下又轉(zhuǎn)化為乙酸等其他酸類物質(zhì)，所以不會(huì)有糖類或乙醇含量過(guò)大的影響，而進(jìn)一步影響發(fā)酵等其他問(wèn)題。糖化、酒化、醋化使麩醋醋醅發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)、繁殖和代謝始終處于一個(gè)適宜的環(huán)境，糖、酒、醋源源不斷交替生成，最終使四川麩醋具有獨(dú)特的圓潤(rùn)、幽香、醇厚的風(fēng)味特色[6]。川南麩醋的大致生產(chǎn)流程見圖1。

圖1 川南麩醋的大致生產(chǎn)流程Fig.1 General production process of southern Sichuan bran vinegar

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)麩醋的研究大多是對(duì)功能菌的篩選、風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)、氨基酸的檢測(cè)及微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，如陳卓等[7]、于華等[8]對(duì)四川麩醋中產(chǎn)酸菌的分離鑒定；Zhang Liqiang等[9]以淀粉酶芽孢桿菌接種的發(fā)酵劑對(duì)保寧麩皮醋中乙酰丙酮和四甲基吡嗪進(jìn)行改良；劉芳等[10]、劉有晴等[11]對(duì)四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸和氨基酸含量的變化進(jìn)行分析；張奶英、甘興[12]對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落動(dòng)態(tài)演替進(jìn)行分析。這些研究為食醋行業(yè)提供一些較為重要的應(yīng)用參考和理論依據(jù)，給麩醋生產(chǎn)研究提供了意見和建議。但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)麩醋的理化性質(zhì)研究還處于起步階段，在實(shí)際生產(chǎn)中還存在酶活力低和發(fā)酵過(guò)程不穩(wěn)定等因素，且目前麩醋的釀造還存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、原料利用率低等問(wèn)題。麩醋的基礎(chǔ)研究還相對(duì)薄弱，關(guān)于川南麩醋發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)變化規(guī)律的研究鮮見報(bào)道[13]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)川南某醋廠醋醅入池發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，通過(guò)對(duì)醋醅的水分、淀粉、還原糖、酒精、氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸7項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析，為川南麩醋發(fā)酵是“三邊發(fā)酵”提供了理論依據(jù)，同時(shí)也使研究結(jié)果可以有效指導(dǎo)麩醋的日常生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川南某醋廠其中一個(gè)發(fā)酵池于2019年3月投料，其發(fā)酵周期為0～13 d，每天翻醅前取樣，共14個(gè)樣品。

甲醛、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、酚酞、鹽酸、乙酸鉛、硫酸鈉、石油醚、乙酸鋅：以上試劑均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BG2-140干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FE288酸度計(jì)、ME20E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；ZXC-2磁力攪拌器 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UR118K0004紫外分光光度計(jì) 翱藝儀器(上海)有限公司；HH-S4A水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

水分的檢測(cè)：采用烘干法。

氨基酸態(tài)氮的檢測(cè)：采用甲醛滴定法[14]。

酒精含量的檢測(cè)：醋醅中酒精含量較低，因此其測(cè)定方法參照《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》中糟醅的酒精度測(cè)定方法[15]。

還原糖的檢測(cè)：采用斐林試劑法[16]。

淀粉的檢測(cè)：采用斐林試劑法[17]。

不揮發(fā)酸與揮發(fā)酸的檢測(cè)：采用酸堿滴定法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分的變化

入池發(fā)酵過(guò)程水分的變化規(guī)律見圖2。

圖2 醋醅中水分含量的變化Fig.2 Changes of moisture content in vinegar grains

注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)。

由圖2可知，從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，水分含量在54.9%～60.2%之間上下波動(dòng)，總體略有上升。原因可能是入池初期醋醅中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，而且含氧量高，好氧性微生物快速生長(zhǎng)繁殖代謝，進(jìn)行有氧呼吸，代謝產(chǎn)生大量的水分；由于入池后醋醅表面加蓋使水分散發(fā)不出去等因素。中期含水量呈現(xiàn)上下波動(dòng)狀態(tài)，可能是由于微生物在自身繁殖和代謝過(guò)程中產(chǎn)生水分，另外每天的翻醅會(huì)使得一部分水流失，所以呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，但發(fā)酵后期水分含量在一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

2.2 淀粉和還原糖的變化

醋醅入池發(fā)酵過(guò)程中淀粉和還原糖的變化規(guī)律見圖3。

圖3 醋醅中淀粉和還原糖含量的變化Fig.3 Changes of starch and reducing sugar content in vinegar grains

注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)。

醋醅中的淀粉是發(fā)酵的物質(zhì)基礎(chǔ)，微生物生長(zhǎng)代謝需要足夠的碳源物質(zhì)，而糖類是微生物生長(zhǎng)的重要能量來(lái)源。由圖3可知，經(jīng)過(guò)0～13 d的發(fā)酵，淀粉含量逐漸下降，從33.81 g/100 g干醅降低到26.1 g/100 g干醅，而還原糖含量在2.13～6.85 g/100 g干醅之間波動(dòng)，是一個(gè)先增加后降低的過(guò)程。0～4 d淀粉含量下降明顯，還原糖則一直處于上升狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果和張奶英等對(duì)四川麩醋理化指標(biāo)的結(jié)果大致相同，張奶英等對(duì)醋醅中微生物變化進(jìn)行了分析，出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因?yàn)榍捌诿咕徒湍妇任⑸锷L(zhǎng)代謝旺盛，在整個(gè)微生物生態(tài)中屬于優(yōu)勢(shì)菌，代謝產(chǎn)生大量淀粉酶，淀粉水解產(chǎn)生一些可直接利用的糖類物質(zhì)，所有前期淀粉下降比較快。5～13 d淀粉變化趨于平穩(wěn)，其原因可能是隨著一些酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，醋醅的發(fā)酵環(huán)境偏酸，糖化反應(yīng)相對(duì)降低，使淀粉幾乎不再分解。還原糖處于波動(dòng)狀態(tài)主要是由于糖類物質(zhì)一方面在生成，而另一方面在發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝導(dǎo)致還原糖分解生成乙醇和有機(jī)酸等物質(zhì)，再加上微生物之間的擾亂作用，導(dǎo)致還原糖含量總體處于下降趨勢(shì)。

2.3 酒精含量的變化

醋醅入池發(fā)酵過(guò)程中酒精含量變化規(guī)律見圖4。

圖4 醋醅中酒精含量的變化Fig.4 Changes of alcohol content in vinegar grains

注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)。

由圖4可知，從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程酒精含量的變化來(lái)看，酒精含量呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，在0.13～0.26 mL/100 g之間波動(dòng)。0～4 d酒精含量上升，可能是因?yàn)槿氤貢r(shí)人工添加酵母菌，酵母菌和霉菌分泌的糖化酶將淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖，同時(shí)酵母菌分泌酒化酶再將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精。5～13 d酒精含量慢慢降低，一方面是淀粉極少被利用，糖化減弱，糖含量減少；另一方面，酒精用于醋化反應(yīng)的生酸過(guò)程，酒精含量會(huì)減少，發(fā)酵步入以產(chǎn)酸為主的階段，與此同時(shí)酸化和呼吸作用也都會(huì)消耗酒精，所有酒精含量逐漸減少。

2.4 氨基酸態(tài)氮的變化

入池發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化規(guī)律見圖5。

圖5 醋醅中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen content in vinegar grains

注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)。

氨基酸不僅能使食醋形成獨(dú)特的風(fēng)味，而且使其更加營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)還是很多風(fēng)味物質(zhì)的前體。絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸等都是麩醋中常見的氨基酸[11]。由圖5可知，整個(gè)發(fā)酵周期，氨基酸態(tài)氮的含量從0.42 g/100 g干醅上升到1.14 g/100 g干醅，其中0～1 d氨基酸態(tài)氮大幅度上升至0.85 g/100 g干醅；1～7 d趨于平緩；8～13 d緩慢上升。這一現(xiàn)象與醋醅中產(chǎn)生蛋白酶的微生物有密切聯(lián)系，而蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下降解后生成氨基酸等含氮物質(zhì)。0～1 d隨著微生物的繁殖代謝，原料分解成小分子的肽、氨基酸等，使得氨基酸態(tài)氮的含量快速上升。1～7 d氨基酸的生成和利用處于一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，而8～13 d酒精和酸的存在會(huì)使微生物數(shù)量降低，使蛋白酶等一些酶的活力下降，使氨基酸態(tài)氮上升緩慢。

2.5 不揮發(fā)酸與揮發(fā)酸的變化

入池發(fā)酵過(guò)程中不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸的變化規(guī)律見圖6。

圖6 醋醅中不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸含量的變化Fig.6 Changes of non-volatile acid and volatile acid content in vinegar grains

注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)。

不揮發(fā)酸有乳酸、琥珀酸等，揮發(fā)酸以乙酸為主，適量的揮發(fā)酸能賦予食醋愉悅的香氣，但揮發(fā)酸含量過(guò)高，則帶有尖酸感和不愉快的醋味[10]。由圖6可知，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸的變化趨勢(shì)都一直上升，并伴有相隨關(guān)系。不揮發(fā)酸最高達(dá)8.99 g/100 g干醅(以乳酸計(jì))，揮發(fā)酸最高達(dá)4.71 g/100 g干醅(以乙酸計(jì))。其中0～1 d，醋醅中不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸含量快速上升，由于酵母等微生物的代謝作用，糖類物質(zhì)被代謝成醇類、酸類等物質(zhì)。甘興[12]通過(guò)Illumina HiSeq測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的多樣性在酒化過(guò)程中逐漸上升，從而使發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸等不揮發(fā)酸的含量增長(zhǎng)。發(fā)酵2～7 d，不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸上升相對(duì)緩慢。8～13 d醋酸菌和其他產(chǎn)酸菌起主要作用，醋醅中的乙醇轉(zhuǎn)化成醋酸等物質(zhì)，使醋醅中的乙醇含量減少，同時(shí)不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸含量增加。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的醇類、酸類物質(zhì)等代謝產(chǎn)物也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和各個(gè)階段的代謝。

3 結(jié)論

連續(xù)測(cè)定川南某醋廠入池發(fā)酵過(guò)程中7項(xiàng)理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。發(fā)酵初期階段，霉菌、酵母菌等一些好氧性微生物在微生物生態(tài)中占主導(dǎo)地位，且醋醅間隙中有空氣存在，可進(jìn)行有氧呼吸，從而分泌纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等，將原料中的纖維、淀粉、蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)分解為還原糖、氨基酸等一些小分子物質(zhì)。然后利用這些物質(zhì)生長(zhǎng)和代謝，生成大量水、酸、乙醇、氨基酸等。其中醋醅水分維持在54.9%～60.2%；淀粉含量的變化規(guī)律與其工藝有較大關(guān)系，經(jīng)過(guò)0～13 d連續(xù)發(fā)酵，淀粉的利用率只有21.71%，有大部分淀粉不能充分利用；還原糖和酒精含量總體呈先增加后降低的趨勢(shì)；氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵過(guò)程中一直上升，從0.42 g/100 g干醅上升到1.14 g/100 g干醅；有機(jī)酸包括不揮發(fā)酸和揮發(fā)酸，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不揮發(fā)酸最高含量達(dá)到8.99 g/100 g干醅(以乳酸菌計(jì))，揮發(fā)酸最高含量達(dá)4.71 g/100 g干醅(以乙酸計(jì))。

從發(fā)酵過(guò)程中多項(xiàng)指標(biāo)變化可以看出，川南麩醋發(fā)酵過(guò)程大致分為3個(gè)階段：0～1 d淀粉的含量以最快速度下降，所以此階段主要為糖化階段，同時(shí)酒精、氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸、揮發(fā)酸都快速上升，所以糖化還伴隨著酒化、醋化作用；2～7 d酒精含量首先快速上升后緩慢降低，不揮發(fā)酸和揮發(fā)性酸含量也同步上升，此階段酒化伴隨著醋化，同時(shí)還有緩慢的糖化作用；8～13 d主要為醋化階段，淀粉幾乎沒有被利用，還原糖含量降低，氨基酸態(tài)氮緩慢上升，酒精持續(xù)下降幾乎消耗殆盡；且此階段不揮發(fā)酸和揮性酸的含量上升。酸的不斷增多除了部分耐酸的乳酸菌及醋酸菌以外，大多數(shù)微生物生長(zhǎng)和代謝都受到抑制，風(fēng)味物質(zhì)如酯類、醛類、醇類、酮類等復(fù)合物大多也在這個(gè)階段形成。因此，本試驗(yàn)表明川南麩醋發(fā)酵過(guò)程是典型的具有“三邊發(fā)酵”過(guò)程。

研究醋醅入池發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于麩醋發(fā)酵質(zhì)量的判斷和生產(chǎn)過(guò)程的控制有較大的參考價(jià)值。就傳統(tǒng)麩醋來(lái)說(shuō)，生料發(fā)酵一直存在原料利用率低的問(wèn)題，在發(fā)酵過(guò)程中，只有前期和后期有明顯原料被利用和物質(zhì)生成的現(xiàn)象，中間有段時(shí)間大量微生物代謝活動(dòng)可能基本處于停止?fàn)顟B(tài)。因此，連續(xù)測(cè)定川南麩醋的理化指標(biāo)為解決川南麩醋生產(chǎn)過(guò)程中醋醅入池發(fā)酵過(guò)程難以劃分等問(wèn)題提供了一些清晰的理解思路，也為川南麩醋發(fā)酵周期長(zhǎng)、原料利用率較低等問(wèn)題做了鋪墊。