馬延紅，孫僑生，段志芳，劉文華

(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

小茴香(FoeniculumvulgareMill.)為傘形科茴香屬多年生草本植物茴香的干燥成熟果實(shí)，具有散寒止痛、理氣和胃的功效[1]，是《中國(guó)藥典》收載的一味傳統(tǒng)中藥，也常作為調(diào)味品和香料使用，主要含有揮發(fā)油、生物堿、黃酮、脂肪酸、甾醇和糖苷等多種類型的化合物[2]。

揮發(fā)油是小茴香的主要有效成分之一，也是發(fā)揮生理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。主要是單萜類化合物和苯丙烷類化合物，反式茴香腦作為小茴香揮發(fā)油的主要成分，相對(duì)含量可達(dá)到65%～80%[4]。此類化合物存在于小茴香內(nèi)，具有強(qiáng)烈的茴香香味，并可隨水蒸氣揮發(fā)[5,6]。水蒸氣蒸餾法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[7]，且對(duì)揮發(fā)油中的微量成分提取效率高，可以得到絕大部分的揮發(fā)性香氣成分[8]，在小茴香揮發(fā)油提取方法中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，是目前提取小茴香揮發(fā)油的主要方法。但水蒸氣蒸餾法的提取效率容易受到物料粉碎粒度、料液比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等多種因素的影響。因此，本試驗(yàn)以小茴香為原料，采用水蒸氣蒸餾法研究不同提取條件對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響，確定最佳提取工藝，為小茴香精油的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。同時(shí)，利用體外抗氧化試驗(yàn)測(cè)定小茴香精油的總還原能力、羥自由基清除率和DPPH清除率，評(píng)定其體外抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小茴香：廣州市清平藥材市場(chǎng)；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品：廣東光華科技股份有限公司；DPPH：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW型電子天平 賽多利斯公司；Q-800D型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司；DK-98-II型電爐 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小茴香揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1.3.1.1 小茴香揮發(fā)油提取流程

將小茴香粉碎、過(guò)篩，加入浸提劑，用水蒸氣蒸餾法(依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇不同的粉碎粒度、料液比、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間)提取小茴香揮發(fā)油。經(jīng)水油分離、無(wú)水硫酸鈉除水后，密封保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.1.2 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)選取不同的料液比、粉碎粒度、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

料液比的確定：準(zhǔn)確稱取10 g小茴香粉末，過(guò)20目篩，分別加入150，200，250，300 mL蒸餾水作提取溶劑，固定粉碎粒度為20目，浸泡時(shí)間為0 h，蒸餾時(shí)間為3 h，在以上條件下提取小茴香揮發(fā)油。

粉碎粒度的確定：準(zhǔn)確稱取10 g小茴香粉末，分別過(guò)20，50，60，100目篩，加入250 mL蒸餾水作提取溶劑，固定料液比為1∶25，浸泡時(shí)間為0 h，蒸餾時(shí)間為3 h，在以上條件下提取小茴香揮發(fā)油。

浸泡時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱取10 g小茴香粉末，過(guò)20目篩，加入250 mL蒸餾水作提取溶劑，分別浸泡0，1，2，3 h后提取，固定料液比為1∶25，粉碎粒度為20目，蒸餾時(shí)間為3 h，在以上條件下提取小茴香揮發(fā)油。

蒸餾時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱取10 g小茴香粉末，過(guò)20目篩，加入250 mL蒸餾水作提取溶劑，固定料液比為1∶25，粉碎粒度為20目，浸泡時(shí)間為0 h，分別蒸餾3，4，5，6 h，在以上條件下提取小茴香揮發(fā)油。

1.3.1.3 正交試驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化小茴香揮發(fā)油的提取工藝，在以上4個(gè)單因素試驗(yàn)中，選擇溶劑料液比、物料粉碎粒度、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.2 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.2.1 DPPH法

稱取不同量的揮發(fā)油于50 mL的容量瓶中，用95%乙醇將樣品配制成0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，將1 mL上述藥液加入2 mL濃度為0.5 mmol/L的DPPH 溶液，室溫遮光放置30 min，反應(yīng)完全后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，取平均值。用對(duì)應(yīng)濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組，并以抗壞血酸濃度和自由基清除率做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品結(jié)果以每克樣品中所含抗壞血酸相當(dāng)量來(lái)表示[9]。

DPPH清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

式中：A0為未加藥時(shí)DPPH溶液的吸光度；A1為抗壞血酸溶液或樣品溶液加DPPH溶液的吸光度。

1.3.2.2 總還原能力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[10]。稱取0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同濃度的小茴香揮發(fā)油溶液各1 mL加入試管中，依次加入2.5 mL的PBS溶液和2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6，混勻，于50 ℃恒溫水浴20 min，加入10% 三氯乙酸溶液2.5 mL，用轉(zhuǎn)速為3000 r/min的離心機(jī)離心10 min，取上清液2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，室溫放置10 min后，于700 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，取平均值。以與藥液同樣濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2.3 羥自由基清除率[11]

取5支10 mL試管，分別加入0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同濃度的小茴香揮發(fā)油溶液，再依次向各試管中加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻后，室溫靜置10 min。再向各試管中加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，搖勻，置于50 ℃恒溫水浴30 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)平行樣，取平均值。以與藥液同樣濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，并以抗壞血酸濃度和自由基清除率做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品結(jié)果以每克樣品中所含抗壞血酸相當(dāng)量來(lái)表示。

羥自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式中：A0為95%乙醇溶液的吸光度；A1為抗壞血酸溶液或樣品溶液的吸光度；A2為用95%乙醇代替水楊酸時(shí)樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的確定

不同比例的料液比對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同料液比對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of different ratios of solid to liquid on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由圖1可知，當(dāng)料液比為1∶15～1∶30，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，揮發(fā)油的得率最大。因此，選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30 3個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.1.2 粉碎粒度的確定

不同粉碎粒度對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同粉碎粒度對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of different crushing particle size on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由圖2可知，在20，50，60，100目條件下，粉碎粒度對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響較小，當(dāng)粉碎粒度為60目時(shí)，揮發(fā)油得率最大。選擇50，60，100目3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 浸泡時(shí)間的確定

揮發(fā)油提取過(guò)程中，浸泡與否及浸泡時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響揮發(fā)油的得率。不同浸泡時(shí)間對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同浸泡時(shí)間對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of different soaking time on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由圖3可知，當(dāng)浸泡時(shí)間分別為0，1，2，3 h時(shí)，揮發(fā)油提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，但變化較平穩(wěn)，且在浸泡時(shí)間為2 h時(shí)，揮發(fā)油得率最大。選擇1，2，3 h 3個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.1.4 蒸餾時(shí)間的確定

不同蒸餾時(shí)間對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同蒸餾時(shí)間對(duì)小茴香揮發(fā)油提取率的影響Fig.4 Effect of different distillation time on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由圖4可知，當(dāng)蒸餾時(shí)間為3，4，5，6 h時(shí)，小茴香揮發(fā)油提取率呈緩慢上升趨勢(shì)，且當(dāng)蒸餾時(shí)間為6 h時(shí)，揮發(fā)油得率最大。因此，選擇4，5，6 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 小茴香揮發(fā)油提取工藝因素水平Table 1 The factors and levels of extraction process of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

表2 小茴香揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2 Orthogonal test design and results analysis of volatile oils extraction from Foeniculum vulgare Mill.

以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，由表2可知，在小茴香揮發(fā)油提取過(guò)程中，各因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響大小依次是A>D>C>B，即蒸餾時(shí)間>粉碎粒度>浸泡時(shí)間>料液比。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，小茴香揮發(fā)油提取的最佳工藝條件是A3B2C1D3，即蒸餾時(shí)間為6 h，料液比為1∶25，浸泡時(shí)間為1 h，粉碎粒度為100目時(shí)，結(jié)果最優(yōu)。結(jié)合試驗(yàn)中的揮發(fā)油提取率結(jié)果，證實(shí)了在該組合條件下，揮發(fā)油得率為3.6412%，優(yōu)于其他試驗(yàn)組合。

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 清除DPPH自由基和羥自由基的能力

通過(guò)測(cè)定小茴香揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除率和對(duì)羥自由基的清除率，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。研究結(jié)果表明，小茴香揮發(fā)油具有較好的體外抗氧化活性，見(jiàn)表3。

表3 小茴香揮發(fā)油清除自由基能力Table 3 The ability of Foeniculum vulgare Mill. volatile oils to scavenge free radicals

小茴香揮發(fā)油的抗氧化能力以Vc當(dāng)量來(lái)表示，由表3可知，在0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL濃度下，小茴香揮發(fā)油對(duì)自由基清除率(DPPH法)用Vc相當(dāng)量表示分別為7.9，20.0，31.8，53.5，80.0 mg/g；對(duì)羥自由基清除率用Vc相當(dāng)量表示分別為60.5，36.2，35.8，44.3，48.2 mg/g。

2.3.2 總還原能力

總還原能力的測(cè)定是利用樣品的抗氧化性，將赤血鹽還原后，再與Fe3+作用，生成普魯士藍(lán)，以普魯士藍(lán)的生成量表示樣品的還原能力，并以吸光度值來(lái)表示，吸光度值越高，說(shuō)明樣品的還原能力越強(qiáng)[12]。

圖5 小茴香揮發(fā)油與抗壞血酸總還原能力的比較Fig.5 Comparison of total reducing capacity between volatile oils of Foeniculum vulgare Mill. and ascorbic acid

由圖5可知，小茴香揮發(fā)油的還原能力與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，濃度越高，還原能力越強(qiáng)。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，以此來(lái)評(píng)價(jià)小茴香揮發(fā)油的總還原能力。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮發(fā)油的提取工藝，最佳提取條件為：蒸餾時(shí)間為6 h，料液比為1∶25，浸泡時(shí)間為1 h，粉碎粒度為100目。在此條件下提取小茴香揮發(fā)油，出油率為3.6412%。并采用3種體外抗氧化活性檢測(cè)方法(DPPH法、羥自由基清除率、總還原能力測(cè)定)評(píng)價(jià)小茴香揮發(fā)油的抗氧化活性，結(jié)果表明：小茴香揮發(fā)油具有一定的抗氧化性，且濃度與其抗氧化活性基本呈現(xiàn)正相關(guān)性。本研究通過(guò)優(yōu)化小茴香揮發(fā)油的提取工藝，為小茴香揮發(fā)油的加工生產(chǎn)和科學(xué)合理利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。小茴香揮發(fā)油的抗氧化活性研究對(duì)于天然食品來(lái)源的抗氧化劑和保鮮劑的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)和支持[13]。同時(shí)，小茴香不管是作為常用中藥還是日常調(diào)味品，都在人們的生活中占據(jù)著重要地位。通過(guò)研究小茴香揮發(fā)油的體外抗氧化活性對(duì)于深入探究其藥用價(jià)值具有重要的科學(xué)意義。