馬靜 郝莉花 萬夢飛 鞏凡 李存良 趙喜梅

摘 要：建立了靈敏快速的高效液相色譜-熒光檢測器法（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection，HPLC-FLD），檢測小麥粉中L-抗壞血酸與D-異抗壞血酸含量。樣品中的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸采用偏磷酸-乙酸溶液提取，經(jīng)活性炭催化脫氫后，與鄰苯二胺衍生成具有強(qiáng)熒光性的物質(zhì)。以20 mmoL/L磷酸氫二鈉水溶液和乙腈體積比90︰10為流動相，經(jīng)親水性Waters T3 色譜柱分離，用配備熒光檢測器的高效色譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果表明，L-抗壞血酸與D-異抗壞血酸在0.1～

10.0 μg/mL線性良好（R2≥0.999），檢出限和定量限分別為0.7 mg/kg和2.0 mg/kg。以空白樣品為基體，在2.22 mg/kg、22.20 mg/kg和222.00 mg/kg這3個濃度添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，平均添加回收率為93.5%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤1.73%（n=6）。該方法具有操作簡便、靈敏度高、精密度好及準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，成功用于市售11種小麥粉中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸含量的測定。

關(guān)鍵詞：小麥粉;L-抗壞血酸;D-異抗壞血酸;高效液相色譜-熒光檢測器法（HPLC-FLD）

Simultaneous Determination of L-ascorbic Acid and D-isoascorbic Acid in Wheat Flour by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector

MA Jing， HAO Lihua*， WAN Mengfei， GONG Fan， LI Cunliang， ZHAO Ximei

（Henan Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： A sensitive and rapid High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector （HPLC-FLD） method was established to detect the content of L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid in wheat flour. The L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid in the sample were extracted with metaphosphoric acid-acetic acid solution， and then catalyzed dehydrogenation by activated carbon， and then derivatized with o-phenylenediamine into substances with strong fluorescence. Under the condition that the volume ratio of 20 mmoL/L disodium hydrogen phosphate aqueous solution and acetonitrile is 90∶10 as the mobile phase， it was separated on a hydrophilic Waters T3 chromatographic column， and measured with a high-performance chromatograph equipped with a fluorescence detector. The developed HPLC-FLD method exhibited good linearity （R2≥0.999） over the concentration range of 0.1～10.0 μg/mL， low limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） of 0.7 mg/kg and 2.0 mg/kg， respectively. The average recovery rate of L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid under three addition levels of 2.22， 22.20， and 222.00 mg/kg ranged between 93.5%～101.0%， satisfactory precision with relative standard deviations ≤1.73%（n=6）. The method has the advantages of simple operation，high sensitivity，good precision and high accuracy， it has been successfully used for the determination of L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid in 11 kinds of wheat flour on the market.

Keywords： wheat flour; L-ascorbic acid; D-isoascorbic acid; high performance liquid chromatography-

fluorescence detection（HPLC-FLD）

小麥粉作為北方居民的主食之一，含有豐富的膳食纖維、維生素、淀粉等各種營養(yǎng)成分，對人體健康有諸多益處[1]。但是，在過去十年中，突發(fā)性自然災(zāi)害或異常天氣導(dǎo)致全球、區(qū)域和地方各級商業(yè)小麥的質(zhì)量和產(chǎn)量出現(xiàn)了明顯的停滯，引起國際小麥價格波動，給國民經(jīng)濟(jì)造成負(fù)擔(dān)，影響糧食安全[2]。目前，國內(nèi)加工業(yè)主要存在的問題是在某些生產(chǎn)年份，商品小麥生產(chǎn)的品質(zhì)低于市場平均值，劣質(zhì)小麥加工生產(chǎn)出來的小麥面粉質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，可以通過化學(xué)、酶促或物理處理來改善[3]。

L-抗壞血酸，又稱為維生素C，是一種天然存在的具有抗氧化性質(zhì)的有機(jī)化合物，也是一種維持人體正常活動不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。研究表明，在小麥粉中添加L-抗壞血酸可以保證面粉制作食物時的面筋蛋白含量，提高面團(tuán)強(qiáng)度，降低面團(tuán)黏性，因此被廣泛用作面粉改良劑[5]。D-異抗壞血酸常作為抗氧化劑、防腐劑、發(fā)色助劑用于食品工業(yè)，但攝入過多也會使白細(xì)胞的抗病能力明顯下降，會引起尿酸結(jié)石、腹瀉、多尿及皮疹等。根據(jù)GB 2760—2014，小麥粉中允許使用L-抗壞血酸，最大使用量是0.2 g/kg，但不允許使用D-異抗壞血酸。然而，目前的研究主要集中在水果、蔬菜以及飲料中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸總量的測定，且測定過程存在基質(zhì)干擾以及L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸分離不佳的問題。對于小麥粉中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸含量的測定鮮有報道。因此，建立一種高效，靈敏和可靠的方法分離并同時測定小麥粉中的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸具有重要意義。

目前，抗壞血酸的測定方法比較多，有滴定法、電化學(xué)傳感器法、熒光法和高效液相色譜法等。其中，滴定法操作簡單、耗時短，但是不穩(wěn)定，靈敏度低;電化學(xué)傳感器法雖然具有直接、快速、選擇性好和靈敏度高的特點，但是化學(xué)傳感器的構(gòu)建相對麻煩，且穩(wěn)定性較差;高效液相色譜法由于操作簡單、定量準(zhǔn)確而被重視。本文采用高效液相色譜法，結(jié)合熒光檢測器同時測定小麥粉中的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的含量，采用偏磷酸-乙酸溶液提取，經(jīng)活性炭催化脫氫后，與鄰苯二胺衍生成具有強(qiáng)熒光性的物質(zhì)，用配有熒光檢測器的高效液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量，兩者分離效果良好。該方法具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等特點，適用于小麥粉中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的分離測定。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

乙腈（美國Honeywell公司，色譜級）;偏磷酸、冰乙酸和乙酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）;十二水合磷酸氫二鈉（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，分析純）;活性炭粉和鄰苯二胺（上海Maklin有限公司，分析純）;超純水（自制）。

L-抗壞血酸（德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量99.5%）;D-異抗壞血酸的（德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量99.7%）。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;ME-104E 電子分析天平（德國梅特勒-托利多公司）;V-14R 臺式離心機(jī)（美國貝克曼公司）;QL 866 渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;一次性使用無菌注射器（河南曙光匯知康生物科技有限公司）;SB-25-12DT 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;電子天平;渦旋混合器;臺式離心機(jī)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

（1 000 μg/mL）：分別稱取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），用偏磷酸-乙酸溶液定容至10 mL。將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋至濃度為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL及10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。由于L-抗壞血酸對光不穩(wěn)定，遇氧氣易分解，需現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。稱取小麥粉試樣2.5 g（精確至0.01 g），加入25 mL偏磷酸-乙酸溶液，渦旋混合后，10 000 r/min離心5 min，移取上層液體，再加入20 mL偏磷酸-乙酸溶液，經(jīng)相同方法處理后，合并兩次提取液，并用偏磷酸-乙酸溶液定容至50 mL，混勻后待衍生化。

（2）衍生化。取上述提取液25 mL置于50 mL離心管中，加入活性炭粉1.0 g，劇烈搖動5 min，用定性濾紙過濾，取濾液1 mL置于10 mL離心管中，加入乙酸鈉緩沖溶液1 mL，再加入2.5 mL鄰苯二胺甲醇溶液，充分搖勻后，避光條件下放置

35 min后加入0.5 mL偏磷酸-乙酸溶液，混勻后過0.22 μm微孔濾膜后，供高效液相色譜-熒光檢測器法（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection，HPLC-FLD）測定。

同時做空白試驗，除不加試樣外，其余按照1.3.2樣品前處理步驟進(jìn)行操作。

1.3.3 色譜條件

使用Waters T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸進(jìn)行分離;使用熒光檢測器，在激發(fā)波長346 nm，發(fā)射波長428 nm的條件下進(jìn)行測定。柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動相：20 mmoL/L的Na2HPO4水溶液，乙腈（90︰10，v︰v）。

1.3.4 分析方法

樣品經(jīng)過1.3.2樣品前處理后采用液相色譜分析并計算抗壞血酸和異抗壞血酸的峰面積，液相色譜分析抗壞血酸和異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列，并分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)系列中抗壞血酸和異抗壞血酸濃度為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品峰面積代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中外標(biāo)法計算上機(jī)液中抗壞血酸和異抗壞血酸含量，按公式（1）計算樣品中抗壞血酸和異抗壞血酸含量。

式中：X為樣品中抗壞血酸和異抗壞血酸含量，mg/kg;C為上機(jī)液中抗壞血酸和異抗壞血酸的含量，μg/mL;C0為空白樣液中抗壞血酸和異抗壞血酸的含量，μg/mL;V為上機(jī)液最終定容體積，mL;m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

通過改變流動相中水相和有機(jī)相乙腈的比例，研究了不同比例流動相條件下L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的理論塔板數(shù)和分離度，結(jié)合兩者的保留時間，確定了L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸檢測的最佳流動相比例。流動相比例與分析結(jié)果見表1，從表1中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)20 mmoL/L的Na2HPO4水溶液的比例達(dá)到90%的時候，L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸可以得到有效的分離，分離度R為3.61;繼續(xù)增大水相比例，分離度和理論塔板數(shù)繼續(xù)增加，但是保留時間也會進(jìn)一步延長，增加了時間成本。故綜合考慮分離效果、檢測靈敏度和時間，最后選擇

20 mmoL/L的Na2HPO4的水溶液和乙腈體積比90︰10作為HPLC-FLD檢測的流動相。

2.2 色譜柱的選擇

考察了3種色譜柱Waters T3、Eclipse Plus C18、InertSustain C18的分離效果，結(jié)果表明，3種色譜柱對L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)樣品分離的峰形良好，定量無干擾，均能滿足檢測要求。綜合考慮分離度、響應(yīng)值、保留時間以及噪聲，最后選擇Waters T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為0.5 μg/mL的色譜圖如圖1所示。

2.3 線性范圍

準(zhǔn)確移取L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列濃度各25 mL，余下按照1.3.2 樣品前處理中衍生化步驟操作。衍生后的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以峰面積-濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸在0.1～

10.0 μg/mL線性關(guān)系良好。L-抗壞血酸的線性回歸方程：Y=5.443 042 59X-0.194 738 4，R2=0.999 98;

D-異抗壞血酸的線性回歸方程：Y=4.920 889 41X-0.400 512 4，R2=0.999 86。

2.4 加標(biāo)回收實驗

為了確定方法的回收率，選擇不含有L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的小麥粉做空白基質(zhì)，用L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品分別以2.22 mg/kg、22.20 mg/kg、222.00 mg/kg 3個濃度加標(biāo)小麥粉樣品，每個濃度水平設(shè)置6個平行。結(jié)果如表2所示，L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸在小麥粉中的平均回收率分別為96.5%～99.1%和97.8%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.07%～1.73%和1.43%～1.50%。

2.5 市售樣品測定

采用本方法對市售11種小麥粉中的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸進(jìn)行測定，準(zhǔn)確性好，靈敏度高。其中有4批次小麥粉中的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸均未檢測出;有5批次小麥粉檢測出L-抗壞血酸，都在國標(biāo)允許添加的范圍內(nèi);有7批次小麥粉檢測出D-異抗壞血酸。結(jié)果表明，有些小麥粉中確實存在D-異抗壞血酸，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)監(jiān)管部門及生產(chǎn)企業(yè)的重視，加強(qiáng)監(jiān)管。

3 結(jié)語

本文建立的小麥粉中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的高效液相色譜-熒光檢測器分析檢測方法，使用Waters T3色譜柱可以有效實現(xiàn)兩種物質(zhì)的分離，靈敏度高，精密度好，回收率高，且成功應(yīng)用于市售11種小麥粉中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的分離測定。

參考文獻(xiàn)

[1]杜世超.收獲期降雨對春小麥穗發(fā)芽和產(chǎn)量品質(zhì)的影響[D].哈爾濱：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2021.

[2]Kim M J， Kim S S. Determination of the optimum mixture of transglutaminase， l-ascorbic acid and xylanase for the quality and consumer acceptability of bread using response surface methodology[J]. Food science and biotechnology， 2016，25（1）：77-84.

[3]Joye I J，Lagrain B， Delcour J A. Use of chemical redox agents and exogenous enzymes to modify the protein network during breadmaking–A review[J]. Journal of Cereal Science，2009，50（1）：11-21.

[4]張清，李剛.高壓液相色譜法同時測定食品中抗壞血酸與異抗壞血酸的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2013，4（1）：251-256.

[5]Aamodt A， Magnus E M， Faergestad E M. Effect of flour quality， ascorbic acid， and dATEM on dough rheological parameters and hearth loaves characteristics[J].Journal of Food Science，2003，68（7）：2201-2210.

1013501186345