張廣雨，胡志明，褚德朋，戴永平，尹紹靜，嚴(yán)明雄，段焰，孫康，Naila Ilyas，尤祥偉，李義強(qiáng)

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號 266101；

2 云南省煙草公司保山市公司，云南省保山市隆陽區(qū)正陽北路186號 678000；

3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙市芙蓉區(qū)農(nóng)大路1號 410128

煙草青枯病 是我國煙區(qū)普遍發(fā)生的重要土傳性維管束病害，病原菌茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），具有趨化性、運(yùn)動性和廣泛的寄主范圍，發(fā)病初始部位一般在根部，適宜的環(huán)境條件下擴(kuò)展迅速，可造成煙葉減產(chǎn)低質(zhì)甚至絕收[1-3]。生物炭是生物質(zhì)在完全或部分缺氧的條件下經(jīng)熱解得到的一種穩(wěn)定的、高度芳香化的、富含碳的固體材料，具有孔隙多、比表面積大、含氧官能團(tuán)豐富的特征，具有提高土壤pH、改善土壤養(yǎng)分和理化結(jié)構(gòu)、提高微生物多樣性和促進(jìn)植物生長的功效[4-5]。生物炭在防治土傳病害方面也具有應(yīng)用前景，有研究表明，施用生物炭能減少煙草黑脛病、番茄青枯病、西瓜枯萎病等病害的發(fā)生[6-8]，但對防控?zé)煵萸嗫莶〖捌錂C(jī)制的研究較少。基于此，本文結(jié)合室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，研究了生物炭對青枯菌生長、運(yùn)動性及吸附作用的影響，以及生物炭對土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響，以期為生物炭防控?zé)煵萸嗫莶√峁┘夹g(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為小黃金1025，供試菌株為煙草青枯菌1 號生理小種生物型Ⅲ，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)中心提供。供試土壤為煙田土壤與育苗基質(zhì)（m : m=7:3）混合后的土壤，取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨試驗(yàn)基地，基本理化性質(zhì)為：pH 5.26，有機(jī)質(zhì)107.79 g/kg，速效磷1.95 mg/kg，速效鉀308.44 mg/kg，硝態(tài)氮114.03 mg/kg，銨態(tài)氮239.63 mg/kg。供試生物炭為松木生物炭（研磨后過0.12 mm 篩），在450℃厭氧條件下慢速熱解6 h 制成，購自青島貝爾卡環(huán)境生物工程有限公司，其理化性質(zhì)如表1 所示。

表1 生物炭基本理化性質(zhì)Tab. 1 Physical and chemical properties of biochar

1.2 生物炭對青枯菌的影響

1.2.1 生物炭對青枯菌生長的影響

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[9]測定不同生物炭添加量對青枯菌生長的影響。向加有不同生物炭含量的NB 液體培養(yǎng)基（生物炭：NB 培養(yǎng)基；m : v =0/0.5/1.5/3/5 : 100）中接種等量稀釋的青枯病菌懸液（濃度為3×108cfu/mL）， 分 別 為 BC0（CK）、BC0.5、BC1.5、BC3、BC5 處理，每處理3 次重復(fù)，NB 培養(yǎng)基pH：7.0±0.2。30℃下震蕩培養(yǎng)12 h，各處理培養(yǎng)液經(jīng)逐級稀釋9 個(gè)梯度后，吸取10 μL 涂布于含有TTC 的NA 培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)32 h，取適宜記錄的最低稀釋倍數(shù)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

每毫升菌落形成單位（cfu/mL）=同一稀釋度的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100

1.2.2 生物炭對青枯菌的吸附作用和運(yùn)動性的影響

將3×108cfu/mL 青枯菌懸液與生物炭混合，制備成0、0.5%、1.5%、3%、5%（生物炭：菌懸液；m : v）不同生物炭含量的菌懸液。取5 mL 轉(zhuǎn)移到離心管，30℃、90 r/min 震蕩孵育60 min，靜置60 min。取孵育后上清液，用無菌水10 倍梯度稀釋9 個(gè)梯度，吸取10 μL 各梯度樣品涂布于含TTC 的NA 培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h 后記錄各梯度菌落數(shù)，研究吸附作用[9]，計(jì)算方法同1.2.1。運(yùn)動性測定參照谷益安[9]和李石力[10]相關(guān)研究方法：吸取2.5 μL 孵育后的菌液，垂直滴于半固體SMM 培養(yǎng)基（0.35%瓊脂）上，30℃恒溫培養(yǎng)32 h 后測定每個(gè)平板上3 個(gè)菌落的直徑，取平均值，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

運(yùn)動性=測量直徑（mm）-起始接菌直徑（mm）

1.3 生物炭對煙草生長及根際細(xì)菌群落多樣性的影響

該試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，添加不同量生物炭，制備成0、0.5%、1.5%、3%、5%（生物炭：土壤，m : m）不同生物炭含量的土壤，每盆1 kg 土。煙苗培育到大十字期后，用無菌水小心漂洗根部，移栽于不同生物炭含量的土壤中，每處理4 次重復(fù)。在移栽后30 d、60 d，調(diào)查煙株主要農(nóng)藝性狀，包括株高、葉數(shù)、最大葉長和最大葉寬。移栽60 d 后，抖根法收集根際土壤樣品，保存至-80℃，用于根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的測定；四分法收集所有土壤樣品，風(fēng)干后用于理化性質(zhì)的測定。

根際土壤微生物基因組總DNA 采用E.Z.N.A.? soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒提取。使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對 16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化、檢測、定量后使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫。測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司的MiseqPE300 平臺完成。

1.4 生物炭對煙草青枯病的防效試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)在溫室進(jìn)行。煙苗培育到大十字期后，用無菌水小心漂洗根部，分別移栽于0、0.5%、1.5%、3%、5%不同生物炭含量的土壤中，每處理15株，3 次重復(fù)。待煙苗定植10 d 后，采用灌根法接種，每株接種3×108cfu/mL 的青枯菌懸液30 mL，接種后每天觀察煙苗發(fā)病情況，直至對照處理發(fā)病率超過80%，參照煙草病蟲害分級及調(diào)查方法[11]進(jìn)行病害分級，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，并按照四分法收集土壤樣品，于-80℃保存。

發(fā)病率= （發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

病害指數(shù)= [∑（各級病株×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）] ×100

防治效果= （對照處理病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/ 對照處理病情指數(shù)×100%

1.5 土壤理化性質(zhì)測定及其與煙草青枯病發(fā)生的相關(guān)性分析

將土壤樣品風(fēng)干過篩，采用水浸提法測定土壤pH；重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機(jī)質(zhì)；氯化鉀浸提流動分析儀測定硝態(tài)氮銨態(tài)氮；堿解擴(kuò)散法測定堿解氮；鉬銻抗比色法測定速效磷；火焰光度法測定速效鉀[12]。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行土壤理化性質(zhì)和青枯病發(fā)病率、病情指數(shù)的Pearson 相關(guān)性分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)按照97%的相似性聚類成OTU，采用Usearch（vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/）軟件平臺和RDP classifier 貝葉斯算法進(jìn)行分析，在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。細(xì)菌16S rRNA 測序使用silva 數(shù)據(jù)庫（Release132 http://www.arb-silva.de）。使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（P ＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 生物炭對青枯菌的影響

2.1.1 生物炭對青枯菌生長的影響

青枯菌在含有TTC 的NA 培養(yǎng)基上的試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1、圖2），生物炭對煙草青枯菌的生長有一定的抑制作用，這種抑制作用具有濃度依賴性，生物炭用量超過1.5%時(shí)抑制作用顯著，其中5%的生物炭處理效果最好，與對照處理相比，青枯菌濃度降低了14.51%。

圖1 不同生物炭添加量處理的青枯菌濃度Fig. 1 Concentrations of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar

圖2 不同生物炭添加量處理中青枯菌菌落數(shù)（稀釋105 倍）Fig. 2 The number of Ralstonia solanacearum colonies under different dosages of biochar (Diluted 105 times)

2.1.2 生物炭對青枯菌的吸附作用及其運(yùn)動性的影響

含有生物炭的菌懸液培養(yǎng)后，取上清液接種到含TTC 的NA 培養(yǎng)基上的試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3、圖4），生物炭具有吸附青枯菌的能力，且用量越大吸附作用越明顯，稀釋104倍的青枯菌，用1.5%、3%和5%的生物炭處理，其菌落數(shù)量顯著降低，與對照處理相比分別減少了5.56%、7.86%和13.75%。通過測定青枯菌群落運(yùn)動直徑探究生物炭對青枯菌運(yùn)動性的影響，結(jié)果如圖5 所示，在添加量0.5%時(shí)，生物炭就可以顯著降低青枯菌運(yùn)動的范圍半徑，且在0.5%～5%范圍內(nèi)，添加量和抑制運(yùn)動能力成正比，生物炭的添加量越大，青枯菌運(yùn)動性越弱。

2.2 生物炭對煙草青枯病的防效試驗(yàn)

2.2.1 生物炭對煙草青枯病發(fā)生的影響

圖3 不同生物炭添加量的青枯菌濃度Fig. 3 Concentrations of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar

發(fā)病情況結(jié)果如表2 所示，接種13 d 后，CK 發(fā)病率超過80%，但施用生物炭處理的青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)均有所降低。隨著生物炭用量增加，發(fā)病率和病情指數(shù)越低，防效在2.53%～81.38%之間，以BC3 和BC5 處理防效較好，其相對防效分別為78.73%和81.38%。

圖4 不同生物炭添加量對青枯菌的吸附作用（稀釋104 倍）Fig. 4 Adsorption of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar (Diluted 104 times)

圖5 不同生物炭添加量處理青枯菌的運(yùn)動性Fig. 5 Motility of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar

2.2.2 生物炭對土壤理化性質(zhì)的影響及其與青枯病發(fā)生的相關(guān)性

不同生物炭含量的土壤種植煙草后的檢測結(jié)果表明（表3），生物炭處理與對照相比，使用生物炭的土壤pH、速效磷、速效鉀含量比對照高，土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量比對照低，其中BC3、BC5各指標(biāo)差異均達(dá)顯著水平。相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示，土壤理化指標(biāo)與煙草青枯病的病情指數(shù)和發(fā)病率有極顯著或顯著的相關(guān)性，且其相關(guān)系數(shù)大于0.6，其中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量與病情指數(shù)及發(fā)病率呈正相關(guān)，pH、有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)。

表2 盆栽防效試驗(yàn)中不同生物炭添加量對煙草青枯病防治效果的影響Tab. 2 Control effects of different dosages of biochar on tobacco bacterial wilt in pot experiment

表3 盆栽防效試驗(yàn)中不同處理土壤理化性質(zhì)Tab. 3 Physicochemical properties of soil under different treatments in pot experiment

表4 盆栽試驗(yàn)中環(huán)境因子與煙草青枯病發(fā)病情況的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Tab. 4 Pearson correlation coefficient between environmental factors and incidence of tobacco bacterial wilt in pot experiment

2.3 生物炭對煙草生長的影響

添加生物炭對煙草的農(nóng)藝性狀有較明顯的改善作用。由表5、圖6 可知，移栽30 d 后，BC3、BC5 處理株高較CK 顯著增加，不同用量生物炭均能顯著提高有效葉數(shù)而對最大葉長無影響；移栽60 d 后，各處理長勢差距縮小，以BC5 處理長勢最好。

表5 盆栽試驗(yàn)中不同處理烤煙農(nóng)藝性狀Tab. 5 Agronomic characters of flue-cured tobacco under different treatments in pot experiment

2.4 生物炭對根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

2.4.1 根際土壤細(xì)菌多樣性分析

煙苗移栽60 d 后，對施用不同含量生物炭各處理的根際土壤樣品微生物群落的Alpha 多樣性進(jìn)行評估，結(jié)果如表6 所示。各處理覆蓋率為98.77%～99.15%，說明所建的MiSeq 文庫覆蓋了土壤樣品中98.77%以上細(xì)菌，能夠反映樣品中細(xì)菌的真實(shí)組成。BC5 處理顯著提高了Shannon 指數(shù)，其他生物炭處理較對照差異不顯著。Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)，生物炭處理較對照有所提升，以BC5 處理效果顯著。表明生物炭可以提高土壤細(xì)菌的群落豐富度和多樣性，以5%用量生物炭處理效果最明顯。

圖6 不同生物炭添加量處理對煙草生長的影響Fig. 6 Effects of different dosages of biochar on tobacco growth

表6 不同處理下根際土壤細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)Tab. 6 Alpha diversity index of rhizosphere soil bacteria under different treatments

2.4.2 根際土壤細(xì)菌群落組成分析

在門水平上（圖7 a），不同試驗(yàn)處理中優(yōu)勢細(xì)菌類群（相對豐度大于2%）按豐度大小排序?yàn)椋悍啪€菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Patescibacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）。生物炭的添加使細(xì)菌門水平豐度發(fā)生了變化，其中放線菌門（Actinobacteria）變化最明顯，較對照提高了12.07～38.56%。

在屬水平上（圖7 b），各處理根際土壤中鏈霉菌屬（Streptomyces）相對豐度最高，占29.47～49.01%，生物炭處理中該菌相對豐度是對照的1.25～1.66 倍，以BC3處理豐度最高。生物炭還提高了根瘤菌（Rhizobium）、Microscillaceae 的相對豐度，而Saccharimonadales、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、芽單胞菌（Gemmatimonas）在生物炭處理中相對豐度有所降低。

2.4.3 環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

由圖8 可見， BC5、BC3 和CK 的土壤樣品可以明顯區(qū)分，說明3%和5%用量的生物炭對土壤微生物群落產(chǎn)生了較大影響。添加不同量的生物炭后，有效鉀的變化對樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響最大，其次是硝態(tài)氮、pH、有效磷、銨態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)。從圖中箭頭分布可看出，生物炭對土壤理化性質(zhì)的改良是導(dǎo)致其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。

3 討論

生物炭作為一種土壤改良劑，對土壤理化性質(zhì)的改善有顯著效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，生物炭提高了土壤pH、速效磷和速效鉀含量，降低了硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，主要原因是生物炭呈堿性，表面帶負(fù)電荷的官能團(tuán)可吸附土壤中H+，可提高土壤pH[13]；生物炭表面所含的化學(xué)元素和較高的陽離子交換量，對土壤肥力的提升有促進(jìn)作用[14]；生物炭的較大比表面積和表面電荷密度，可增強(qiáng)土壤持水保肥能力[15]；硝態(tài)氮及銨態(tài)氮減少的原因有待于進(jìn)一步研究。綜合來看，生物炭的優(yōu)異理化特性決定了其對土壤有較好的改良作用。相關(guān)性分析表明，病情指數(shù)及發(fā)病率與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)，與pH、有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)，這與鄭世燕[16]的觀點(diǎn)一致，由于生物炭富含孔隙且自身含有營養(yǎng)元素，對土壤理化性質(zhì)有改善作用，減少了煙草青枯病的發(fā)生，有利于煙草的生長，盆栽試驗(yàn)表明，5%用量的生物炭對煙草農(nóng)藝性狀的改善效果最為明顯，這與邵慧蕓[17]和張繼旭[18]研究結(jié)果類似：前者研究發(fā)現(xiàn)煙桿生物炭的添加提高了煙草葉片數(shù)、株高和最大葉面積等，促進(jìn)了烤煙的生長，以0.1%和1.0%效果較佳；后者研究表明，0.2%～1.0%劑量秸稈生物炭提高了烤煙株高、地上部生物量，對煙草有促生作用，與本研究生物炭能促進(jìn)煙草生長的結(jié)果一致，而最佳劑量卻有所差異，這可能是因?yàn)樯锾康膩碓醇靶再|(zhì)不同造成的。

圖7 不同處理下細(xì)菌在門（a）和屬（b）水平的主要群落組成Fig. 7 Main community composition of bacteria at phylum level(a)and genus level(b) under different treatments

圖8 環(huán)境因子與屬水平上細(xì)菌優(yōu)勢類群的冗余分析Fig. 8 Redundancy analysis of environmental factors and bacterial dominant groups at genus level

生物炭對根際微生態(tài)的調(diào)控也有較顯著的作用。根際土壤細(xì)菌Alpha 多樣性評估發(fā)現(xiàn)，Shannon 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)生物炭處理較對照有所提升，以BC5 處理效果最顯著，說明生物炭提高了根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的Alpha 多樣性，這與姜樺韜[19]研究結(jié)果相似。放線菌作為重要的益生菌對植物生長及防控病害均有一定效果[20-21]，根際土壤細(xì)菌群落組成分析發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬為代表的放線菌相對豐度最高，且生物炭處理提高了該菌豐度，對青枯菌有較好的抑制作用[22]，這可能是生物炭利于煙草生長和減少青枯病發(fā)生的原因。生物炭處理后，Saccharimonadales、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、芽單胞菌（Gemmatimonas）的減少，可能是由生物炭的吸附作用和對土壤微生態(tài)的改變所致。微生物多樣性的降低是土傳病害發(fā)生的重要原因[23]，生物炭對細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性的提高可能使其對煙草青枯病具有防控效果，盆栽防效試驗(yàn)驗(yàn)證了這一猜想，結(jié)果表明生物炭明顯降低了發(fā)病率和病情指數(shù)，這與李成江[24]、饒霜[25]的研究結(jié)果一致。當(dāng)然，根際土壤微生態(tài)與土壤理化性質(zhì)也存在相關(guān)性。添加不同量的生物炭后有效鉀含量的變化，對根際土壤中細(xì)菌多樣性的影響最大，然后依次是硝態(tài)氮、pH、有效磷、銨態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)，說明生物炭對土壤理化性質(zhì)的改良是導(dǎo)致其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素，這與施河麗[23]的觀點(diǎn)一致。

生物炭對青枯菌的抑制作用，也對控制青枯病有一定作用。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物炭具有吸附青枯菌、抑制青枯菌生長和運(yùn)動性的能力。生物炭對青枯菌的吸附作用是因?yàn)樯锾堪l(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)和大比表面積賦予其良好的吸附性能，可直接吸附病原菌，以及通過吸附根際分泌物間接吸引病原菌，降低了病原菌對植株的侵染[9]。生物炭對青枯菌生長的抑制作用是由于青枯菌適宜在pH 6.6 的偏酸性環(huán)境中生長[3]，而呈堿性的生物炭可提高環(huán)境pH，另外，生物炭可吸附根際分泌物等養(yǎng)分物質(zhì)[9]，提高微生物間的競爭作用，進(jìn)而影響青枯菌的數(shù)量。運(yùn)動性是微生物尋找寄主植物及在其根部定殖的前提，生物炭顯著降低了青枯菌運(yùn)動的范圍半徑，表明生物炭可以抑制青枯菌的運(yùn)動擴(kuò)散，減少青枯病的發(fā)生。王貽鴻[3]研究表明青枯菌在pH 6.5 的環(huán)境中運(yùn)動性較強(qiáng)，此后隨著pH 的升高青枯菌的運(yùn)動性減弱，說明生物炭對pH的提升，導(dǎo)致青枯菌活動受限，致使病害減輕。

4 結(jié)論

生物炭對煙草青枯病有良好的防治效果，其防控機(jī)理為：（1）生物炭改善了土壤理化性質(zhì)，利于煙草的生長，適當(dāng)提升土壤肥力及土壤pH 是控制煙草青枯病的重要途徑。（2）生物炭提高了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，增加了對青枯菌有抑制作用的放線菌門中鏈霉菌屬的豐度。（3）生物炭對青枯菌有抑制作用，能吸附青枯菌、減弱其運(yùn)動并抑制青枯菌的生長，從而降低青枯菌的侵染能力。