閆梅 陳佛蘭 葉建翔

惠州市第一婦幼保健院，廣東 惠州516007

羊水中因存在胎兒細(xì)胞，使得羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水進(jìn)行染色體分析成為可能，隨著孕周的增加，羊水內(nèi)有活性的胎兒細(xì)胞相對(duì)減少，培養(yǎng)成功率有所下降，但對(duì)大孕周羊水的培養(yǎng)仍然具有一定的價(jià)值。本研究擬在孕中期羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)孕晚期的羊水培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，目的在于提高孕晚期羊水細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，給臨床錯(cuò)過(guò)有效檢查時(shí)機(jī)的孕晚期孕婦提供一個(gè)補(bǔ)救的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2015 年5 月至2018 年7月來(lái)產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行遺傳咨詢并具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦2303 例，年齡（29.8±8.4）歲，孕周（19.4±3.3）周。在孕中期穿刺（16～27W）的孕婦2218 例，在孕晚期（28～38W）穿刺的孕婦85 例。

1.2 方法

1.2.1 孕中期羊水培養(yǎng)方法。羊膜腔穿刺無(wú)菌抽取20mL 羊水，分別注入2 支無(wú)菌的15mL 刻度管內(nèi)，1600r/min 離心棄上清，將沉渣分別接種在2 瓶裝有4mL 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況后換液，再放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)直至收獲。

1.2.2 孕晚期羊水培養(yǎng)方法。羊膜腔穿刺無(wú)菌抽取20mL 羊水，分別注入2 支無(wú)菌的15mL 刻度離心管內(nèi)，1600r/min 離心棄上清，由于孕晚期羊水離心沉渣過(guò)多，接種時(shí)適當(dāng)棄掉一部分沉渣再接種到裝有4mL 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)用力吸打懸液，一周后換液，無(wú)論是否有細(xì)胞貼壁，均將換下來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)液懸液重新接種到一個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入半量的新鮮培養(yǎng)液并用力吸打多次，然后再放入培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，定期在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞克隆達(dá)到滿足一個(gè)低倍鏡大小，數(shù)量在3 個(gè)以上時(shí)即可傳代直至收獲。

1.2.3 收獲。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)克隆傳代后，每天相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%以上，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)圓亮細(xì)胞較多的情況下，滴加100μg/mL 的秋水仙素2 滴，3h 后即可收獲，制片，G 顯帶。

1.2.4 核型分析。以ISCN2013 為核型分析診斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)在2 個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中平均分布的20 個(gè)以上中期分裂相，分析5 個(gè)以上核型，當(dāng)出現(xiàn)2 個(gè)或2 個(gè)以上細(xì)胞系時(shí)增加細(xì)胞計(jì)數(shù)，鑒定嵌合情況。

2 結(jié)果

孕中期的2218 例羊水，培養(yǎng)成功2217 例（99.9%），有1 例因?yàn)檠蛩猎?，貼壁細(xì)胞不能形成有效的細(xì)胞連接，而培養(yǎng)失敗；85 例孕晚期羊水培養(yǎng)成功84例（98.8%），其中1 例使用孕晚期特用的分瓶培養(yǎng)但無(wú)羊水細(xì)胞貼壁，84 例培養(yǎng)成功的孕晚期羊水中發(fā)現(xiàn)7例異常核型，其中21 三體2 例，18 三體一例，4 例為平衡易位，已經(jīng)通過(guò)檢查父母核型，確認(rèn)為父母來(lái)源的異常。

3 討論

目前，羊水細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行染色體核型分析仍然是產(chǎn)前診斷診斷染色體病的主要手段，影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素很多［1］，其中孕周的選擇是非常重要的因素，最適合的孕周為18～24W［2］，本研究顯示，在孕16～27 周因細(xì)胞數(shù)量適中，細(xì)胞活性較好，常規(guī)的細(xì)胞接種，培養(yǎng)，傳代，收獲都能收獲較完美的核型進(jìn)行分析，但是超過(guò)28 周后羊水有型成分增多，常較渾濁，含有較多的死細(xì)胞，雜質(zhì)偏多，經(jīng)常出現(xiàn)無(wú)細(xì)胞貼壁的情況，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。

盡管孕晚期臍血培養(yǎng)具有相對(duì)簡(jiǎn)單，發(fā)放報(bào)告時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但由于穿刺水平的限制及對(duì)臍血穿刺的恐懼及風(fēng)險(xiǎn)的不確定性，本院對(duì)于孕28～36 周的具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦，均抽取羊水進(jìn)行染色體檢測(cè)的病例，其中有部分病例由于進(jìn)行臍帶血穿刺失敗而改為了進(jìn)行羊膜腔穿刺抽取羊水繼續(xù)進(jìn)行核型分析。

本研究顯示，如果用孕中期培養(yǎng)細(xì)胞的方法用于孕晚期的標(biāo)本，孕晚期的標(biāo)本則出現(xiàn)了無(wú)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的情況，即使有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但是細(xì)胞克隆偏少而且克隆偏小，克隆周邊細(xì)胞生長(zhǎng)偏慢且過(guò)于緊實(shí)，細(xì)胞易老化，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)不均勻，易聚攏，收獲后核型少而且短小，本研究發(fā)現(xiàn)7 天換液后將換下的4mL 懸液重新加入到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并分為兩瓶，每瓶在補(bǔ)充2mL 新鮮培養(yǎng)液，用力吸打幾十次，重新放入培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，一般第3 天開(kāi)始就會(huì)有新的細(xì)胞開(kāi)始貼壁，一周后在相差顯微鏡下觀察，就會(huì)見(jiàn)到有明顯的細(xì)胞克隆，生長(zhǎng)方式與孕中期細(xì)胞相似，收獲核型多且有部分核型能達(dá)到G 顯帶400～550 條帶，可能因?yàn)樵型砥谘蛩畠?nèi)的成分較孕中期的復(fù)雜，胎兒脫落的表皮鱗狀上皮細(xì)胞，胎脂，胎糞過(guò)多，而有活性的羊水細(xì)胞隨著孕周的加大而變少，離心后沉渣較多，與孕中期同樣的方法進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)細(xì)胞密度過(guò)大，有活性的羊水細(xì)胞無(wú)有效的空間進(jìn)行貼壁，同時(shí)胎脂等油性成分沉淀到培養(yǎng)瓶底部，影響細(xì)胞的有效貼壁，而7 天后將換下的細(xì)胞懸液重新分瓶并換入新的培養(yǎng)瓶重新進(jìn)行接種后，減少了胎脂的成分及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了稀釋?zhuān)钚缘难蛩?xì)胞貼壁生長(zhǎng)并形成有效的細(xì)胞克隆。張志強(qiáng)等［3］研究認(rèn)為，通過(guò)大力吸打也可起到相同的效果，可能大力吸打細(xì)胞后，包裹在細(xì)胞表面的胎脂油性等成分會(huì)減少，利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。這種方法也存在一定的缺陷，由于存在二次培養(yǎng)，所以細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間增加，報(bào)告的發(fā)放時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，對(duì)于孕周偏大的孕婦，存在報(bào)告時(shí)間與胎兒預(yù)產(chǎn)期的沖突，對(duì)于這樣的病例快速處理，實(shí)驗(yàn)部分結(jié)束后馬上閱片發(fā)放報(bào)告，發(fā)現(xiàn)21 三體兩例，18 三體一例，平衡易位4 例，其中有1 例孕36 周，B 超發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重畸形，而提前引產(chǎn)，染色體分析證實(shí)為18 三體綜合征，由于孕婦未及時(shí)關(guān)注圍產(chǎn)期的孕檢，產(chǎn)前篩查等，發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)前診斷指證時(shí)已經(jīng)超過(guò)了有效的檢測(cè)時(shí)間，又不能常規(guī)的進(jìn)行臍血穿刺，因此對(duì)于孕晚期的孕婦能有效地進(jìn)行羊水染色體核型分析，同樣能有效地預(yù)防染色體病患兒的出生，降低出生缺陷的發(fā)病率。