許金和，王水良，張勝行，賴國祥，蘭小鵬,吳小麗 綜述,余宗陽 審校

(1.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州 350025；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建福州 350025；4.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院腫瘤科，福建福州 350025)

2019 年12 月武漢市出現(xiàn)一種不明原因的肺炎，截至2020年2月有9日全國累計(jì)確診病例已超過70 000例。2020 年1月，NA等[1]對(duì)此類肺炎患者的生物標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該不明原因肺炎的病原體是一種先前未知的冠狀病毒。此種冠狀病毒歸屬于套式病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬,是一類具有包膜、線性單股正鏈的RNA病毒，在自然界中廣泛存在[2-4]。新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是現(xiàn)在已知的第7 種可以感染人的冠狀病毒，其余6 種分別是人冠狀病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)。PENG等[5]和JASPER等[6]通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2有79.5%與SRAS-CoV相同，與蝙蝠冠狀病毒的同源性為96.0%，且證實(shí)SARS-CoV-2與SARS-CoV均通過與細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體結(jié)合的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞[7]。此種新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)傳染性強(qiáng)，臨床癥狀不典型，給臨床診斷和疫情防控帶來很大困難，快速準(zhǔn)確地診斷對(duì)COVID-19 的防控至關(guān)重要。病原學(xué)是診斷新型冠狀病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其存在窗口期、靈敏度低、程序復(fù)雜等缺陷，難以在此次疫情中得到廣泛應(yīng)用，而病毒的核酸檢測(cè)也是確診SARS-CoV-2 的金標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度更高，定量檢測(cè)可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病毒感染的程度并觀察療效，因此核酸檢測(cè)在此次SARS-CoV-2 的診斷及疫情的防控中承擔(dān)不可或缺的作用。本文將對(duì)目前常用的病毒核酸診斷技術(shù)的基本原理和應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是目前官方使用的SARS-CoV-2 確診方法，目前有很多關(guān)于應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)冠狀病毒的報(bào)道。SARS-CoV-2 屬RNA 病毒，需要先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所得到的樣本循環(huán)閾值(Ct)的大小，可以判斷患者標(biāo)本中是否含有SARS-CoV-2。截至目前國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)共批準(zhǔn)7種SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒，其中的6種試劑盒為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，1種為聯(lián)合探針錨定測(cè)序法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)病毒模板RNA 進(jìn)行定量分析[8]，整個(gè)檢測(cè)過程無需對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行后期處理，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，而且可以降低檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)的污染和假陽性；還可以通過繪制熔解曲線、使用特異性探針等方式降低非特異性擴(kuò)增，所以相對(duì)于常規(guī)RT-PCR，其具有操作簡(jiǎn)便快捷，特異度強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。

PABBARAJU等[11]建立了探針法多重RT-PCR，該方法可以在2個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)同一流感病毒的不同亞型。其他學(xué)者的研究均表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)靈敏度高于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)[12-15]，國內(nèi)研究學(xué)者也報(bào)道了很多應(yīng)用探針進(jìn)行流感病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR[16-18]。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的弊端在于如果病毒基因組在探針結(jié)合的部位發(fā)生變異，可能會(huì)影響探針的結(jié)合效率而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，而聯(lián)合探針錨定測(cè)序法是指在病毒基因組DNA(由逆轉(zhuǎn)錄得到)經(jīng)片段化處理形成的DNA納米球上將DNA分子錨和熒光探針進(jìn)行聚合，通過高分辨率成像系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行采集，采集到的光信號(hào)經(jīng)數(shù)字化處理后即可獲得病毒基因組的待測(cè)序列，這一方法的具體技術(shù)細(xì)節(jié)尚未被完整披露，與PCR不同的是該方法能夠獲得特定的病毒基因組序列，即使病毒的部分基因組序列出現(xiàn)變異，也不影響整體同源性的比對(duì)。目前RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2感染的準(zhǔn)確性為30.0%～50.0%，精確度更高的檢測(cè)試劑盒有待進(jìn)一步研發(fā)。

2 等溫?cái)U(kuò)增

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)是在固定的溫度條件下即可實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，反應(yīng)過程無需溫控循環(huán)系統(tǒng)，可大幅度降低檢測(cè)成本，所需設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，大大提高檢測(cè)效率[19-20]。疫情階段臨床檢測(cè)過程中資源不足且需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有望取代傳統(tǒng)PCR診斷技術(shù)。較為常見的等溫?cái)U(kuò)增方法有重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、依賴核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、LAMP等。

2.1RPA技術(shù) 2006年HOFF等[21]報(bào)道RPA技術(shù)，該技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、靈敏，反應(yīng)最適溫度在37～42 ℃[22]，低成本、耗時(shí)短，整個(gè)過程在10～30 min內(nèi)即可完成[23-24]，可實(shí)現(xiàn)核酸的快速檢測(cè)。ELWAHED等[25]利用部分核衣殼基因RNA分子建立RT-RPA法檢測(cè)MERS-CoV，只需要3～7 min就可檢測(cè)最低10個(gè)拷貝的RNA分子。與其他等溫?cái)U(kuò)增方法相比，RPA對(duì)抑制劑具有更大的耐受性[26]，可用于更復(fù)雜的樣品，RPA引物、探針設(shè)計(jì)較為簡(jiǎn)單，其熒光檢測(cè)反應(yīng)體系只需一對(duì)引物和一個(gè)探針即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增并實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。此外，RPA技術(shù)除緩沖液及Mg2+外，體系其余組分均以干粉狀態(tài)保存于反應(yīng)管中，穩(wěn)定且易于保存，在封閉的反應(yīng)體系中也減少了污染的可能性。盡管RPA技術(shù)被認(rèn)為有望取代PCR核酸檢測(cè)。但現(xiàn)階段仍存在一些缺點(diǎn)，如在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物需要純化、當(dāng)模板濃度較低時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異信號(hào)而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。目前，國內(nèi)對(duì)于RPA在病原檢測(cè)方面的相關(guān)研究報(bào)道較少，所以雖然該技術(shù)具有許多優(yōu)勢(shì)，但在SARS-CoV-2檢測(cè)中目前并未有該技術(shù)具體應(yīng)用的報(bào)道。

2.2NASBA技術(shù) NASBA是一項(xiàng)以RNA模板進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增并能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法，該技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，反應(yīng)依賴于3種酶(AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H)、兩種特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作，通過光電信號(hào)的變化情況對(duì)靶RNA進(jìn)行定性、定量研究[27-28]。檢測(cè)過程只需4 h左右，擴(kuò)增效率、靈敏度也較常規(guī)RT-PCR高，與嵌套PCR靈敏度相近[29]。NASBA是全封閉反應(yīng)，不易被污染，并且是一種高通量的檢測(cè)方法，對(duì)于大規(guī)模樣品的篩查有一定的優(yōu)勢(shì)，用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記分子信標(biāo)，可在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同的目標(biāo)RNA擴(kuò)增情況，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等多種病原微生物的檢測(cè)[29-31]。NASBA方法也存在靈敏度不高、假陰性、假陽性等缺點(diǎn)，便攜式NASBA檢測(cè)儀的出現(xiàn)，使該技術(shù)更適于現(xiàn)場(chǎng)診斷，當(dāng)前我國需要篩查的人群仍很大，此方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，但目前還未有關(guān)于NASBA用于SARS-CoV-2檢測(cè)的具體報(bào)道。

2.3LAMP 技術(shù) LAMP是2000年由日本研究人員MORI等[32]發(fā)明的一種新型體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)，該種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高，反應(yīng)迅速，特異度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。LAMP有賴于2對(duì)引物(能夠識(shí)別靶序列6個(gè)特異性區(qū)域)和一種DNA聚合酶(具有鏈置換性)[33]。LAMP過程無需經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄、模板變性，擴(kuò)增循環(huán)過程無溫度變化，基因的擴(kuò)增和檢測(cè)可一步完成，大大縮短檢測(cè)所需時(shí)間，1～2 h即可完成，同時(shí)檢測(cè)者可直觀觀察到反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂以確定反應(yīng)結(jié)果。但由于LAMP法中6個(gè)目標(biāo)區(qū)域要與所使用的2對(duì)引物完全覆蓋，這就導(dǎo)致LAMP的引物設(shè)計(jì)非常復(fù)雜，而且極易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。為了在診斷過程中一次性高效鑒別感染源，實(shí)現(xiàn)感染病例快速確診，準(zhǔn)確排除疑似病例的目標(biāo)，2016年清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系、北京大學(xué)人民醫(yī)院等共同研發(fā)出病原體核酸快速檢測(cè)系統(tǒng)——恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片病毒快速檢測(cè)系統(tǒng)[34]，其將恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與碟式微流控芯片技術(shù)結(jié)合，只需采集患者痰液、咽拭子等分泌物樣本，就可在1.5 h內(nèi)一次性檢測(cè)多種病原體，最低檢出限為50拷貝/反應(yīng)。在本次疫情中，對(duì)于大量疑似患者來說，臨床上急需能一次性檢測(cè)多個(gè)病原體的檢測(cè)試劑產(chǎn)品，此次該團(tuán)隊(duì)再次共同設(shè)計(jì)開發(fā)的包括SARS-CoV-2在內(nèi)的“6種核酸檢測(cè)芯片系統(tǒng)[35](恒溫?cái)U(kuò)增芯片法)”已應(yīng)急獲批投入臨床使用。

3 基于CRISPR/Cas 基因核酸檢測(cè)技術(shù)

2017年張鋒教授及其團(tuán)隊(duì)建立了一種基于CRISPR的診斷技術(shù)(CRISPR-Dx),可快速檢測(cè)特異DNA或RNA，此項(xiàng)技術(shù)基于效應(yīng)分子cas13a(原稱C2c2)的分子檢測(cè)平臺(tái)，稱為SHERLOCK[36-38]。SHERLOCK平臺(tái)可以進(jìn)一步應(yīng)用于一般的RNA/DNA定量，可代替特定的qPCR檢測(cè)。張鋒教授團(tuán)隊(duì)已證明SHERLOCK是一種成本低、用途廣、可信賴的RNA和DNA檢測(cè)方法，適用于包括傳染病和敏感基因分型在內(nèi)的快速診斷，幾乎所有經(jīng)過測(cè)試的crRNA都具有很高的靈敏度和特異度。近期該團(tuán)隊(duì)利用合成的SARS-CoV-2 RNA片段進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在很低的病毒RNA水平下(10～100 copy/μL)，該技術(shù)仍能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到SARS-CoV-2 RNA序列[39]。檢測(cè)結(jié)果可以直觀地展示在試紙上，整個(gè)過程可在1 h內(nèi)完成，操作過程不需要復(fù)雜的設(shè)備、高端的技術(shù)人員，普通的醫(yī)務(wù)人員即可在現(xiàn)場(chǎng)快速確認(rèn)患者是否出現(xiàn)SARS-CoV-2感染。但由于這項(xiàng)技術(shù)還比較初步，尚未在真實(shí)COVID-19患者樣本中做過檢測(cè)，因此該方法目前不能用于臨床上對(duì)COVID-19患者的診斷，還有待進(jìn)一步的臨床研究。

4 基因芯片

基因芯片是指將大量的核酸分子(擴(kuò)增的cDNA或合成的特異性寡核苷酸探針)以大規(guī)模陣列形式固化在由玻璃或硅晶片制成的芯片上。基因芯片可用于不同樣本的基因表達(dá)分析，通過將樣本與熒光素標(biāo)記的樣品進(jìn)行核酸雜交，以雜交信號(hào)的有無和強(qiáng)弱來判斷樣品中待檢分子的種類和數(shù)量?；蛐酒且环N多學(xué)科融合的高新科學(xué)技術(shù)，屬于一種新型檢測(cè)分析手段，具有準(zhǔn)確、快速、高通量等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的病原培養(yǎng)法和流感臨床擬診相比，具有更高的符合率、特異度及陰性預(yù)測(cè)值[40-41]，在病毒快速檢測(cè)和疾病診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景。2003年“非典”期間，程京院士等團(tuán)隊(duì)已運(yùn)用相關(guān)技術(shù)研制出用于SARS病毒檢測(cè)的基因芯片[42]，此次該團(tuán)隊(duì)也已研制出可以一次性檢測(cè)包括SARS-CoV-2在內(nèi)的19種呼吸道常見病毒的微流控芯片，現(xiàn)已投入臨床使用[43]。但其也有不足之處，如不能區(qū)分定植、污染與感染，不能提供藥敏信息，尚不能在檢出很多混合病原體時(shí)判斷感染的責(zé)任病原體，這些尚需進(jìn)一步的研究及方法學(xué)的改進(jìn)。

5 病毒基因組測(cè)序

宏基因組二代測(cè)序法(mNGS)指的是以宏基因組為研究對(duì)象，直接利用NGS對(duì)臨床標(biāo)本中的基因組進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)病原微生物的快速識(shí)別、性能鑒定、功能研究以及微生物間、微生物與環(huán)境間相互關(guān)系的研究[44]。與前述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR相比，NGS不但可以鑒定新的病毒株，也可用于早期低病毒水平標(biāo)本的檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)可疑或灰區(qū)結(jié)果的確認(rèn)。由于SARS-CoV-2傳播過程可能發(fā)生變異，高深度mNGS可以彌補(bǔ)RT-PCR的缺點(diǎn)，并可監(jiān)測(cè)可能出現(xiàn)的變異，同時(shí)對(duì)于部分病毒含量較低的樣本，mNGS可以提高檢測(cè)陽性率。但鑒于目前大多數(shù)醫(yī)院缺乏測(cè)序設(shè)備、缺乏進(jìn)行測(cè)序結(jié)果解讀的生信人員、缺乏研發(fā)階段的流程和試劑配比的優(yōu)化、缺乏陽性和陰性參考品的設(shè)立以及初步預(yù)臨床試驗(yàn)的支持，再加上NGS的高成本和較長(zhǎng)檢測(cè)周期，目前還不適合于常規(guī)臨床檢測(cè)。

6 小 結(jié)

SARS-CoV-2 感染是當(dāng)前全球面臨的嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生事件，迄今全國已超過70 000 人感染，早期確診、盡早隔離、積極干預(yù)是有效控制疫情蔓延的關(guān)鍵。目前核酸檢測(cè)是確診COVID-19 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。每一種核酸檢測(cè)方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，目前沒有任何一種檢測(cè)方法能夠做到零漏檢，針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)目的，根據(jù)檢測(cè)人群特點(diǎn)以及臨床優(yōu)勢(shì)選擇適合的檢測(cè)技術(shù)。同時(shí)為減少假陰性和假陽性，增加診斷的準(zhǔn)確性，不同方法交叉檢測(cè)印證可進(jìn)一步提高靈敏度和特異度。此外，開展SARS-CoV-2 感染檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室必須建立健全生物安全法規(guī)、技術(shù)操作規(guī)程、質(zhì)量保證措施，確保檢測(cè)結(jié)果真實(shí)、準(zhǔn)確、可靠。