周凡琦 冷 靜 運(yùn)晨霞,3

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530200，電子郵箱：1468749694@qq.com；2 廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，南寧市 530200；3 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院，南寧市 530010)

【提要】 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動障礙等。闡明RA的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制，對于RA的診治尤為重要。研究表明，Toll樣受體在RA患者關(guān)節(jié)周圍的免疫細(xì)胞及滑膜細(xì)胞中的表達(dá)均有所改變，參與了RA的發(fā)生和發(fā)展，在RA的發(fā)病進(jìn)程中扮演著重要作用。本文就Toll樣受體的表達(dá)模式、識別配體及其與RA的相關(guān)性，以及Toll樣受體靶向藥物在RA中的應(yīng)用作一綜述，為進(jìn)一步了解RA的發(fā)病機(jī)制提供參考。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是較為常見的慢性自身免疫性疾病，病因多樣。RA的主要特征是手與腳的小關(guān)節(jié)呈向心性對稱發(fā)病，老年患者可能會波及遠(yuǎn)端大關(guān)節(jié)，病程長者往往出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，更為嚴(yán)重者可導(dǎo)致功能喪失[1]。但目前RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種天然免疫識別受體，在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均起重要作用。TLR除了識別特定的病原相關(guān)分子模式外，還可以識別機(jī)體內(nèi)部產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式，而激活TLR信號通路可導(dǎo)致各種炎癥性因子表達(dá)升高。研究表明，TLR的異常表達(dá)、外源性或內(nèi)源性配體對TLR通路的不當(dāng)觸發(fā)可能導(dǎo)致自身免疫性反應(yīng)和組織損傷[1-2]。因此，本文就TLR的表達(dá)模式、識別配體及其與RA的相關(guān)性，以及TLR靶向藥物在RA中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步了解RA的發(fā)病機(jī)制及防治提供參考。

1 TLR的表達(dá)模式、識別配體及其與RA的相關(guān)性

TLR是Medzhitov等[3]從哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有與果蠅體內(nèi)相似的Toll蛋白分子后命名的。隨著對TLR的不斷研究，學(xué)者們先后從人體中發(fā)現(xiàn)了10種TLR，分別是TLR1～10。其中，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)膜表面，識別微生物的脂質(zhì)、脂蛋白和蛋白質(zhì)等；而其他TLR主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，識別微生物的核酸[4]。正常情況下，TLR主要表達(dá)在多種免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等[2]；而在疾病狀態(tài)下，TLR也表達(dá)在相應(yīng)病變部位的內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞上，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

1.1 TLR1 TLR1主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面，通常和TLR2形成異源二聚體，主要識別三乙?；募半木厶荹5-6]，常與TLR2一起參與對微生物制劑的先天免疫反應(yīng)。而在RA患者體內(nèi)，TLR1也表達(dá)在RA患者關(guān)節(jié)的滑膜成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上[7]，但具體機(jī)制尚無文獻(xiàn)報告，推測TLR1同TLR2一起受外源性配體的刺激直接或間接引起了T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活，從而參與RA的發(fā)生。

1.2 TLR2 TLR2主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞表面，常與TLR1或TLR6配對形成異二聚體的形式[5]，主要識別外源性的革蘭陽性菌的肽聚糖、胞壁酸以及非典型的脂多糖，也識別分枝桿菌的脂蛋白、錐形蟲的糖肌醇磷脂、真菌的酵母多糖，以及宿主體內(nèi)產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式(如熱休克蛋白等)[8]。臨床研究表明，TLR2可高度表達(dá)在與RA相關(guān)的滑膜組織系的巨噬細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)，以及RA患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)上，并且TLR2信號通路的活化可明顯誘導(dǎo)FLS的遷移和其對關(guān)節(jié)的侵襲，并促使細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶而引起關(guān)節(jié)的炎癥[8-9]。TLR2與其配體結(jié)合后，還可使RA患者FLS以及PBMC釋放白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-17等炎癥因子，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨炎癥和退化[10]。動物實驗研究表明，在大鼠或小鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)注射TLR2配體(如鏈球菌細(xì)胞壁片段)可誘導(dǎo)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性的炎癥和關(guān)節(jié)炎發(fā)生，此外，增加TLR2的表達(dá)也可以增強(qiáng)膠原蛋白誘導(dǎo)的RA[11]。這均表明細(xì)胞表面TLR2表達(dá)增加，或者受配體刺激后信號通路的活化，均可誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，從而參與RA的發(fā)病過程。

1.3 TLR3 與其他TLR的表達(dá)模式不同，TLR3在胎盤和胰腺中表達(dá)最豐富，但僅限于表達(dá)在樹突狀細(xì)胞亞群上；而在其他組織中TLR3也可以表達(dá)在T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上[12-14]。TLR3主要識別的配體為病毒的雙鏈RNA以及壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性配體雙鏈RNA[15]。TLR3的信號通路與其他TLR不同，只有非依賴MyD88途徑，其使用β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β,TRIF)作為唯一適配器，最終通過干擾素調(diào)節(jié)因子3和核因子κB信號通路的活化，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用[16]。

臨床研究顯示，RA患者在患病早期滑膜組織及關(guān)節(jié)的FLS上TLR3表達(dá)水平升高，這可能與RA患者滑膜中存在腸道菌群釋放的DNA和肽聚糖有關(guān)，這些成分的存在可導(dǎo)致TLR3的活化[17-18]。同時在RA患者關(guān)節(jié)中，壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性RNA也可作為配體激活TLR3信號通路，而活化的TLR3通路誘發(fā)產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1、IL-6、IL-17等炎癥因子，又能增加FLS中TLR3的表達(dá)，從而加重關(guān)節(jié)炎癥[19]。動物實驗研究表明，微小RNA-26a可抑制TLR3的表達(dá)，通過抑制TLR3信號通路的活化，使降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠的癥狀得到緩解，目前微小RNA-26a已經(jīng)成為與TLR信號傳導(dǎo)相關(guān)的炎癥性疾病的藥物治療靶點(diǎn)[20]。以上研究結(jié)表明，TLR3在RA發(fā)生、發(fā)展中均具有重要作用，而抑制TLR3信號通路可抑制關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。

1.4 TLR4 TLR4主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞及各組織器官的上皮細(xì)胞表面[21]。TRL4除了能識別外源性病原相關(guān)分子模式，如革蘭陰性菌的LPS、呼吸道合胞病毒F蛋白、透明質(zhì)酸寡糖外，也可以識別宿主細(xì)胞內(nèi)的損傷病原相關(guān)分子模式，如熱休克蛋白60/70、硫酸肝素蛋白多糖成分以及纖粘連蛋白和纖維蛋白原[22]。臨床研究結(jié)果顯示，TLR4與RA的發(fā)病密切相關(guān)，在RA患者的PBMC以及滑膜組織/滑液中抗原呈遞細(xì)胞表面的TLR4表達(dá)水平均升高；TLR4受配體刺激后可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，啟動機(jī)體的炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織和骨組織的破壞[23-25]。體外研究也表明RA滑膜細(xì)胞或巨噬細(xì)胞受到脂多糖刺激后，TLR4相關(guān)信號通路即核因子κB、絲裂原活化蛋白激酶等炎癥信號通路活化，從而導(dǎo)致炎癥因子大量釋放，引起關(guān)節(jié)滑膜的炎癥；而抑制TLR4信號通路可有效抑制TNF-α、IL-1、IL-6的分泌[26]。此外，在TLR4基因缺乏的小鼠中，Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率低，關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度降低[27]。由此可見，TLR4在RA的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。

1.5 TLR5 TLR5主要表達(dá)在髓源性細(xì)胞，如單核-巨噬細(xì)胞，其識別的配體主要是細(xì)菌鞭毛，以及RA患者關(guān)節(jié)FLS產(chǎn)生的內(nèi)源性配體[28-29]。研究表明，來源于RA患者單核-巨噬細(xì)胞和滑膜組織上皮細(xì)胞的TLR5表達(dá)比健康對照組更高[27]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR5不僅調(diào)節(jié)RA單核細(xì)胞中的TNF-α的表達(dá)，而且TLR5的表達(dá)水平與TNF-α的產(chǎn)生以及RA疾病的嚴(yán)重程度評分密切相關(guān)[26]。因此，有效靶向調(diào)控TLR5有可能降低TNF-α的表達(dá)并降低RA嚴(yán)重程度。

1.6 TLR6 TLR6主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞等表面，易與TLR2形成異源二聚體，其識別與TLR2相同的外源性配體，如革蘭陽性菌的胞壁酸、真菌的酵母多糖及支原體的二脂酰脂肽和一部分TLR2的內(nèi)源性受體[30]。盡管TLR1、TLR2和TLR6有相同的表達(dá)模式，但在B細(xì)胞表面TLR1和TLR6比TLR2表達(dá)的更多[31]，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)TLR6在RA中的作用。

1.7 TLR7與TLR8 TLR7與TLR8的作用極其相似，但表達(dá)部位不同。TLR7主要是表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞，包括單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及B細(xì)胞表面；而TLR8主要表達(dá)在髓系細(xì)胞上，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓系樹突狀細(xì)胞[32-33]。TLR7和TLR8識別的配體主要以病毒單鏈RNA為主，也可識別咪唑喹啉化合物。研究表明，TLR7和TLR8都可表達(dá)于RA滑膜組織內(nèi)膜、滑膜巨噬細(xì)胞以及FLS表面，并且經(jīng)炎癥因子IL-17和IL-8刺激后TLR7的表達(dá)水平可增加，而經(jīng)脂多糖LPS和IL-1刺激后TLR8的表達(dá)水平亦可增加，從而加重RA的炎癥反應(yīng)[34]。動物實驗研究表明，建立膠原誘導(dǎo)的RA小鼠模型后，體內(nèi)TLR7遺傳缺失小鼠的關(guān)節(jié)炎癥明顯輕于TLR7表達(dá)正常的小鼠[35]。這些研究均揭示了TLR7和TLR8在RA發(fā)病過程中的潛在作用。

1.8 TLR9 TLR9主要表達(dá)在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、記憶性B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞非免疫細(xì)胞的胞內(nèi)內(nèi)膜上[36]。其主要識別細(xì)菌或病毒非甲基化的脫氧胞苷酸磷酸鹽-脫氧鳥苷酸DNA。研究表明，通過抑制RA模型鼠TLR9的表達(dá)可以緩解RA疾病的嚴(yán)重程度，這表明過度表達(dá)的TLR9可以導(dǎo)致RA的疾病進(jìn)展[37]。

1.9 TLR10 TLR10只表達(dá)在人而不表達(dá)在嚙齒類動物的免疫細(xì)胞上，以B細(xì)胞表達(dá)最多[38]。TLR10可以與TLR2形成異源二聚體，因此可以對TLR2識別的配體產(chǎn)生反應(yīng)[39-40]，但是對于TLR10本身的配體和功能目前尚未進(jìn)一步研究[41]。

2 TLR靶向藥物在RA中的應(yīng)用

鑒于TLR在RA中的作用，很多TLR的拮抗劑正在被研發(fā)或已用于RA的臨床治療。

2.1 OPN-305和OPN-301 兩者是人源化的單克隆抗體，是TLR2的拮抗劑，能夠阻斷TLR2/1和TLR2/6介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明， OPN-305和OPN-301可阻斷體外培養(yǎng)的RA滑膜組織中 TLR2信號通路，可以有效抑制RA患者體外培養(yǎng)物分泌炎癥因子，并能抑制 RA 滑膜成纖維細(xì)胞的遷移和侵襲[42]。這為臨床防治RA提供了治療基礎(chǔ)。

2.2 NI-0101 NI-0101是阻斷TLR4的第一代人源性單克隆抗體，可與TLR4的配體決定部位結(jié)合，干擾TLR4二聚化，從而抑制TLR4通路的活化。目前用于急慢性炎癥、自身免疫疾病的臨床前研究[43]。此外，NI-0101目前正在開發(fā)用于RA的治療，具有個體化用藥的潛力[44]。

2.3 CU-CPT8m分子和CPG-52364 CU-CPT8m分子可抑制TLR8的活性，而對其他TLR幾乎沒有任何影響；復(fù)合抑制劑CPG-52364是選擇性TLR7/8/9拮抗劑，目前這兩者還處于臨床前研究。研究表明，CU-CPT8m可以有效地降低骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α等炎癥因子的水平，這表明作為TLR8抑制劑，CU-CPT8m分子具有成為抗炎藥物的潛力[45]。動物實驗顯示，復(fù)合抑制劑CPG-52364對系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病具有抑制作用，目前正在進(jìn)行一期臨床實驗[46]。因此，CU-CPT8m分子、復(fù)合抑制劑CPG-52364有望成為靶向治療RA的潛力藥物。

2.4 羥基氯喹 羥基氯喹是TLR7/9的抑制劑，臨床上廣泛用于治療瘧疾和RA。羥基氯喹可顯著抑制CpG誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α分泌，其機(jī)制是通過抑制TLR9介導(dǎo)的B細(xì)胞功能；同時其也能拮抗TLR7和TLR8[47]。研究表明，羥基氯喹聯(lián)合中藥獨(dú)活寄生湯或甲氨蝶呤治療可明顯降低 RA患者體內(nèi)的炎性因子水平，能夠顯著緩解 RA 病情，改善關(guān)節(jié)活動[48-49]。

2.5 CpG-c41分子 動物實驗表明，CpG-c41分子可通過競爭性結(jié)合TLR9受體阻斷其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，同時還能交叉干擾脂多糖誘發(fā)的TLR4信號通路，抑制IL-6的分泌[50]，可為未來臨床RA的防治提供治療基礎(chǔ)。

3 展 望

隨著對TLR研究的不斷深入，TLR的來源、結(jié)構(gòu)、配體、信號通路及生物學(xué)功能逐漸被認(rèn)識。了解每一種TLR及其在炎癥中的作用，將有利于我們對RA發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解，也可以為RA的防治提供更多的思路。