王懿哲 李珂 談亞姣 姜朋濤

西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021

中醫(yī)藥及其有效成分的研究在疾病預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用［1，2］。發(fā)現(xiàn)及利用這些中醫(yī)藥資源對醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義。苦龍膽酯苷（Amarogentin，AG）是一種天然裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，屬于中藥獐牙菜屬植物的活性成分之一，是目前該類化合物中已知最苦的。在傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中被用來治療多種類型的疾病。在實(shí)驗(yàn)動物模型體內(nèi)藥代動力學(xué)過程符合二室模型，即在靜脈給藥途徑中，藥物在中央室的分布相對于周邊室較快，并且?guī)缀鯚o體內(nèi)毒性作用。近年關(guān)于對苦龍膽酯苷的研究表明其具有抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和調(diào)控免疫功能等作用；同時在多種疾病的發(fā)展中起到抑制和治療作用。本文旨在綜述苦龍膽酯苷相關(guān)研究進(jìn)展，為后續(xù)研究提供指導(dǎo)。

1 苦龍膽酯苷概述

1.1 來源 苦龍膽酯苷是獐牙菜屬藥用植物的主要有效成分。該屬植物來源以龍膽科獐牙菜屬為主，在我國主要分布在西南地區(qū)。有文獻(xiàn)報(bào)道從川東獐牙菜、印度獐牙菜、龍膽草、輻花肋柱花等植物中提取的方法及化學(xué)合成方法，以獐牙菜為原材料的提取方法中，乙醇法萃取正丁醇部位提取的苦龍膽酯苷定粗提粉末獲得率為（18.33±1.20）%，最終純化后用高壓液相檢測儀測得純度大于99.21%［3］。但未有報(bào)道能夠完全人工合成苦龍膽酯苷，僅能合成部分分子基團(tuán)［4］。

1.2 理化性質(zhì) 苦龍膽酯苷屬于離子型藥物，藥物極性高，不易通過細(xì)胞膜脂質(zhì)層。室溫下水中溶解度僅為0.27mg/mL；乙酸乙酯中可以達(dá)到12.1mg/mL；甲醇中溶解最好，溶解度超過100mg/mL。體積分?jǐn)?shù)20%PEG400可以顯著提高苦龍膽酯苷在水中的溶解度，對動物安全無害，不會影響藥物的檢測，是非常適合的助溶劑［5］。

1.3 活性測定 通過在龍膽科植物中建立抗AG單克隆抗體定量檢測AG含量，以此推斷龍膽科植物提取物的潛在活性。研究表明，間接酶聯(lián)免疫方法檢出范圍為 1.95～62.5ng/mL，檢出最低值為 1.28ng/mL，與傳統(tǒng)高效液相色譜相比靈敏度提高了30～625倍，批內(nèi)變異＜3.9%，批間變異＜8.8%，加標(biāo)樣品回收率在91%～106.4%之間，與之前所報(bào)道的其他定量分析方法相比更為廉價和環(huán)保［6］。

1.4 苦龍膽酯苷的醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用 獐芽菜大多性寒味苦，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)、藏醫(yī)藥學(xué)及印度醫(yī)藥學(xué)中，被以多種形式來治療發(fā)熱和腸道疾??；同時還有降血糖、護(hù)肝、驅(qū)除腸內(nèi)寄生蟲、抗腫瘤等作用。文獻(xiàn)報(bào)道［7］，將其葉和剁碎的根莖在水中浸泡過夜用來治療高血壓和偏頭痛，還有其他形式的用藥方式用其治療包括瘧疾、瘴氣、皮膚疾病（皰疹，濕疹等）、胃腸道疾?。ǜ篂a，嘔吐等）、潰瘍、腎臟疾病、蝎子咬傷、月經(jīng)量過多等。同時認(rèn)為它是一種無毒的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用藥。

1.5 毒性作用和體內(nèi)代謝 對于任何一種理想的藥物來說，其合成或來源的簡易性、藥物自身穩(wěn)定性、口服可用性、良好的藥物代謝動力學(xué)特性、組織毒性、成癮性都是至關(guān)重要的。目前尚未有報(bào)道表明苦龍膽酯苷在實(shí)驗(yàn)動物模型中出現(xiàn)毒性作用?？诜?000mg/kg劑量下測定AG的急性中毒時未發(fā)現(xiàn)任何毒性作用，所有動物在 14 天后仍然存活［8］；在 0.2μg/kg·d 劑量給藥條件下30天后，將小鼠處死，其肝臟、腎臟、心肌、肺與對照組相比未出現(xiàn)異常變化［9］；在AG作用后在血液病理學(xué)，組織學(xué)染色，以及肝功能相關(guān)的特異性酶的檢測中表現(xiàn)無毒性［7］。藥物半衰期和血漿清除率均比較穩(wěn)定，且消除迅速，靜脈注射AG在家兔體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究報(bào)告顯示，AG具有較快的血漿清除率和廣泛地組織分布，其消除半衰期約為30min［8］。苦龍膽酯苷口服生物利用度低，當(dāng)給藥量提高至50mg/kg時，仍然無法在血漿樣品中檢測出。在給藥6.25～25mg/kg，藥物的最大血藥質(zhì)量濃度（Cmax）與給藥量的改變不成正比［5］。

2 苦龍膽酯苷的研究進(jìn)展

2.1 苦龍膽酯苷與肝纖維化及肝癌 肝纖維化是由于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等引起的肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，而這些病因長期存在于機(jī)體就會導(dǎo)致肝硬化的形成，最后惡化形成肝癌。2018年，全球約有84萬新發(fā)肝癌患者，發(fā)展中國家的發(fā)病率占大多數(shù)［10］。因此在肝纖維化期的預(yù)防和肝癌形成后阻斷其發(fā)生發(fā)展都極為重要。

AG可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程及MAPK通路影響代謝而表現(xiàn)抗肝纖維化［11］，AG 作用后，ALT、AST 及 Hyp水平與對照組相比明顯降低。并且AG處理后大鼠肝臟炎癥細(xì)胞浸潤及膠原沉積程度明顯減少，提示AG對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化有改善作用。還通過其抗氧化活性調(diào)節(jié)氨基酸的合成以及氧自由基對肝細(xì)胞的損傷。AG基于對色氨酸代謝障礙的調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)5-羥基吲哚-3乙酸和吲哚乙酸在肝纖維化小鼠血漿中的含量降低。AG調(diào)節(jié)肝纖維化小鼠脂肪酸的代謝紊亂，改善了血清中的低能量水平［12］。

在采用四氯化碳/N-亞硝基二乙胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，AG持續(xù)治療處理后小鼠存活率升高，體重增加；治療組Bax-Bcl2的表達(dá)上調(diào)、caspase-3活化、聚ADP核糖聚合酶裂解從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對照組在第10、20、30周時分別出現(xiàn)中重度異性增生及肝細(xì)胞癌。表明AG能在輕度發(fā)育不良期阻斷肝癌的發(fā)展。從第10周開始，AG處理組中LIMD1、RBSP3和p16的表達(dá)明顯增加，cdc25A明顯降低，導(dǎo)致了CDK2/4/6的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致了在第20周時ppRb807/811和ppRb567的表達(dá)下調(diào)，由此限制了細(xì)胞的增殖，p53和p21在第 20周和cMyc、cyclinD1、mdm2在第30周的下調(diào)可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而發(fā)揮協(xié)同作用［13］。研究表明［14］，有0.5%～2.5%的肝癌起源于腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs），同時，也與肝癌的復(fù)發(fā)，腫瘤轉(zhuǎn)移，放化療的耐藥有關(guān)。同樣在采用四氯化碳/N-亞硝基二乙胺誘導(dǎo)的小鼠模型中與腫瘤對照組相比，AG在腫瘤發(fā)生的前后均能顯著下調(diào)CD44陽性CSCs細(xì)胞的數(shù)量。在肝損傷病灶中，AG影響Wnt信號通路，明顯抑制βcatenin、phosphob-catenin（Y-654）的表達(dá)，可能是由于上調(diào)了Wnt通路antagonists sFRP1/2和APC的表達(dá)。在Hedgehog通路中，AG下調(diào)了Gli1，sonic hedgehog ligand和SMO的表達(dá)，上調(diào)了PTCH1的表達(dá)。在肝損傷組織中，AG上調(diào)上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin），下調(diào)表皮生長因子受體（EGFR）。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AG對HEPG2細(xì)胞株的生長具有劑量依賴的抑制作用，且與CD44陽性細(xì)胞的數(shù)量呈相關(guān)性［14］。AG能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，在24、48和72h時，AG對LO2細(xì)胞的半數(shù)最大抑制濃度（IC 50）分別為173.93、141.0和115.5μg/mL，對 HepG2細(xì)胞的 IC 50分別為 132.90、110.30和78.61μg/mL，對SMMC-7721細(xì)胞的IC 50分別為 181.15、123.78 和 86.67μg/mL。p53 在移植瘤（HepG2、SMMC-7721）小鼠模型體內(nèi)的關(guān)于AG的研究，對照組腫瘤組織重量明顯大于預(yù)防組，但僅略大于治療組，表明其潛在的預(yù)防作用可能更為重要。免疫組化、WB以及q-PCR等方式對相關(guān)基因表達(dá)的檢測表明，苦龍膽酯苷可能是通過提高p53以及下調(diào)端粒逆轉(zhuǎn)錄酶、Akt和NF-κB P65的表達(dá)來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡［9］。

2.2 苦龍膽酯苷與其他癌癥 在腫瘤治療過程中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡在腫瘤發(fā)展的控制及治療中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡障礙與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在不同的腫瘤細(xì)胞中廣泛存在誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞產(chǎn)物。AG可參與β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）催化產(chǎn)生氫氰酸，從而抑制細(xì)胞色素c氧化酶、細(xì)胞色素c氧化酶的懸浮酶以及三磷酸腺苷的合成導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而在多種腫瘤細(xì)胞中硫羥化酶的含量較正常細(xì)胞低，對產(chǎn)生的氫氰酸解毒能力不足，同時腫瘤細(xì)胞糖酵解中產(chǎn)生的乳酸增強(qiáng)氫氰酸的作用，使其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用增強(qiáng)。所以AG具有特異性抗癌作用［15］。AG的抗癌作用首次被報(bào)道是在小鼠皮膚癌模型中出現(xiàn)的抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡作用［7］。在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，AG具有劑量依賴性誘導(dǎo)SNU-16人胃癌細(xì)胞早期、晚期凋亡作用。并且異種移植瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤體積明顯小于未處理組，這一過程可能與AG過度活化PI3K/Akt下調(diào)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)有關(guān)，PI3K/Akt通路在細(xì)胞凋亡，增殖，存活和分化中起到重要作用，磷酸化Akt通路可以促進(jìn)細(xì)胞存活能力及增殖，而Akt激酶的過度表達(dá)和激活與惡性發(fā)展密切相關(guān)；另外，cyclin D1和cyclinE的表達(dá)明顯上調(diào)則誘導(dǎo)G2/M時相細(xì)胞周期的抑制。有報(bào)道稱PI3K/Akt信號通路在非小細(xì)胞肺癌及子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，所以AG也可能會參與這些癌癥的抑制過程［16］。AG還能夠?qū)翰杷兀‥GCG）抑制宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生協(xié)同作用，聯(lián)合用藥時誘導(dǎo)凋亡的效果遠(yuǎn)大于單一用藥組，抗凋亡蛋白的表達(dá)與單一用藥組相比明顯下調(diào)，其他細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)也表現(xiàn)出明顯差異，并且提升G1/S細(xì)胞周期的阻滯作用［17］。

2.3 苦龍膽酯苷與糖尿病 糖尿病是一種基于胰島素分泌絕對或相對不足而引起的以血糖升高為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，主要分為兩類，胰島素依賴性糖尿?。═1MD）和胰島素非依賴性糖尿病（T2MD）。目前在全球約有4.25億成人（20～79歲）糖尿病患者，而在我國有約1.14億［18］。AG對T1MD大鼠模型的高血糖改善情況呈劑量依賴性，在大鼠體內(nèi)能夠逆轉(zhuǎn)骨骼肌中GLUT的下降和下調(diào)肝臟中已升高的PEPCK的表達(dá)?？诜咸烟悄土繉?shí)驗(yàn)結(jié)果也表明AG以劑量依賴性的方式產(chǎn)生降低血糖的作用，其作用在60min時最明顯，且這種作用與葡萄糖誘導(dǎo)分泌內(nèi)源性胰島素水平增高無關(guān)。并且在T2MD大鼠模型體內(nèi)，AG能夠增加胰島素敏感性［19］。還有研究表明AG能夠改善小鼠糖尿病模型血脂水平和肝功能［8］。

2.4 苦龍膽酯苷與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化是目前心腦血管類疾病形成的主要原因之一，其主要的病理特點(diǎn)是動脈管壁上的異常脂質(zhì)堆積。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球每年約有2000萬人死于動脈粥樣硬化相關(guān)疾病。AG通過與AMPK的α2亞基相互作用使其活化，并且誘導(dǎo)AMPK及其下游靶點(diǎn)乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化，從而增強(qiáng)了肌管對葡萄糖的攝取，阻斷腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮炎癥產(chǎn)生的膠原和脂質(zhì)的沉積是動脈粥樣硬化斑塊形成的核心，口服AG可以減弱糖尿病介導(dǎo)的新生內(nèi)膜的增厚以及脂質(zhì)在主動脈內(nèi)膜的沉積，有效降低血液中甘油三酯，低密度脂蛋白，極低密度脂蛋白水平同時提升高密度脂蛋白的含量，降低膠原蛋白的重要組分羥脯氨酸的含量。AG還可能通過抑制PLC 2-PKC-p47級聯(lián)和MAPK信號通路而消除血小板活化，抑制人血小板中膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，減少血栓形成。表明其具有治療閉塞性大血管病變的潛能［8，20］。

2.5 苦龍膽酯苷與皮膚病 AG抑制肥大細(xì)胞合成腫瘤壞死因子，進(jìn)而抑制IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）的表達(dá)，還可間接影響神經(jīng)細(xì)胞生長因子和IL-6且這種作用與AG的體內(nèi)苦味受體（TAS2R1和TAS2R38受體）相關(guān)［21］。AG能夠通過誘導(dǎo)表皮神經(jīng)酰胺合成酶-3的表達(dá)調(diào)節(jié)人角質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)合成，改善皮膚屏障問題，例如皮膚干燥和特應(yīng)性皮炎等［22］。這種對人肥大細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用使AG具有緩解皮膚炎癥及瘙癢、支氣管擴(kuò)張等慢性炎癥性疾病的潛質(zhì)，同時，AG對組胺的釋放無影響［21］。

2.6 苦龍膽酯苷與黑熱病 黑熱病是一種由杜氏利什曼原蟲引起的經(jīng)白蛉傳播的慢性傳染病，主要引起肝、脾、骨髓、淋巴結(jié)損害和免疫功能低下。AG通過與杜氏利什曼原蟲DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-1結(jié)合，抑制該酶與DNA的結(jié)合形成二元復(fù)合物，從而殺死體內(nèi)杜氏利什曼原蟲［7］。因此在黑熱病的治療中發(fā)揮重要作用。

3 小結(jié)和展望

AG作為一種中草藥活性成分，其在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較好的醫(yī)用價值，在我國古代醫(yī)藥典藏記錄中，AG被用來治療多種類型的疾病，通過本文綜述可知，AG能夠阻斷小鼠肝纖維化、肝癌、皮膚癌以及人胃癌細(xì)胞系和宮頸癌細(xì)胞系的發(fā)生發(fā)展，阻斷動脈粥樣硬化的形成，治療皮膚屏障引起相關(guān)皮膚病，改善糖尿病小鼠模型的代謝功能和通過阻斷杜氏利什曼原蟲的體內(nèi)繁殖來治療黑熱病的作用。

實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，AG在多個領(lǐng)域的治療作用已被證實(shí)，表明其在未來具有良好的作為臨床用藥的潛質(zhì)，但其相關(guān)的具體機(jī)制仍然不十分清楚，并且缺少毒理學(xué)研究，需要在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)進(jìn)行毒性作用和相關(guān)機(jī)制的探究，以評估在人體內(nèi)應(yīng)用的安全性問題。同時缺乏一些有效的生物學(xué)工具進(jìn)行研究，比如目前存在的問題在于需要一個合適的單克隆抗體能夠使AG和β-Glucosidase的結(jié)合，以用來治療腫瘤［15］。

目前，對于AG的研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果均基于細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)，而且關(guān)于AG劑量、劑型的研究不多，所以限制其使用，這也將是以后的研究重點(diǎn)之一，臨床實(shí)驗(yàn)表明，以脂質(zhì)體為載體遞送藥物的方式已經(jīng)是治療腫瘤、真菌和其他寄生蟲感染的最好選擇，文獻(xiàn)報(bào)道在倉鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明以脂質(zhì)體和游離體的形式給藥所表現(xiàn)出的藥物活性和安全性更高［7］。另外，目前的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)不足以提供臨床指導(dǎo)作用，有學(xué)者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，AG能夠抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，但是由于藥物本身性質(zhì)，對于其能否通過血腦屏障需要實(shí)驗(yàn)證實(shí)。