張 格，鄭連明，2，何浩陽，林 華，詹肖茜，李克景

(1.廈門大學海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102；2.廈門大學海洋生物多樣性與全球變化研究中心，福建 廈門 361102)

長江口是我國眾多水生生物重要的棲息、繁衍所在地，內(nèi)接長江，外連東海，是一個相對獨立的半咸水水系，其鄰近水域魚類及其補充群體具有復雜性和多樣性[1-2]。魚類早期個體(包括魚卵和仔稚魚)的種類分布及數(shù)量變化是評估海域魚類產(chǎn)卵場、親魚資源量、漁業(yè)資源補充量最直接有效的數(shù)據(jù)資料，但有研究表明長江口魚卵、仔稚魚群落發(fā)生變化，經(jīng)濟魚類補充群體有所下降[3-5]。長江口及其鄰近海域魚卵、仔稚魚多樣性研究已有較好的基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)積累[6-8]，但多數(shù)研究是基于傳統(tǒng)形態(tài)分類所得的結(jié)果，多數(shù)魚卵只能鑒定到屬或科的水平，部分仔稚魚無法鑒定到種。

DNA條形編碼(DNA barcoding)是一種基于分子生物學技術(shù)進行物種鑒定的新方法。Hebert等[9]對11個門的13 320個物種進行COI基因序列分析后認為其能很好地區(qū)分研究物種。DNA條形碼技術(shù)在魚類浮游生物中的應用將成為形態(tài)鑒定強有力的補充，彌補傳統(tǒng)魚卵、仔稚魚研究的不足[10-12]。近年來，利用線粒體基因序列比對進行的魚類浮游生物的鑒定已經(jīng)取得了一定的進展，例如：Lin等[13]利用DNA條形碼研究了東海魚類浮游生物群落結(jié)構(gòu)與長江沖淡水和黑潮等水團的關(guān)系。以往大部分長江口魚卵、仔稚魚研究是關(guān)于種類組成、分布格局及其影響因素，關(guān)于潮汐作用的影響研究甚少，本研究利用2017年在長江口海域設(shè)置的兩個連續(xù)觀測站采得的魚卵、仔稚魚，結(jié)合形態(tài)學及DNA條形碼數(shù)據(jù)對魚類浮游生物的種類和豐度進行分析，探討了其與潮汐之間的關(guān)系，同時探討了DNA條形碼在魚卵、仔稚魚鑒定中的可行性，旨在為長江口魚類浮游生物多樣性及漁業(yè)資源調(diào)查提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與形態(tài)學鑒定

本研究于2017年7月16日至2017年7月21日在長江口海域設(shè)置2個連續(xù)站L1(31°12′07″N、122° 48′15″ E)、L4(31° 12′06″ N、122° 59′53″ E)進行24 h連續(xù)觀測(圖1)，每3 h用海水大型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)口直徑80 cm、網(wǎng)長280 cm、孔徑0.505 mm)由底至表進行魚類浮游生物垂直采樣，采集的樣品先用中性甲醛溶液固定，3 h后轉(zhuǎn)入無水乙醇中并低溫保存。同步采集的環(huán)境要素，包括水溫、鹽度、溶解氧等。樣品的采集，保存和室內(nèi)分析均按照《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T 12763.6—2007)中規(guī)定的方法進行[14]。樣品參考《中國近海及其鄰近海域魚卵與仔稚魚》《臺灣海域魚卵圖鑒》在室內(nèi)體視顯微鏡下依據(jù)形態(tài)特征進行分揀[12，15]，根據(jù)初步鑒定結(jié)果，選取具有代表性個體采集圖像后進行DNA條形碼分析。

1.2 DNA條形碼序列獲取

樣品圖像采集后，立即用雙蒸水進行清洗。仔稚魚取尾部或背部肌肉2～25 mg，魚卵用完整單個魚卵，利用TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0按照說明書進行樣品的DNA提取。選取全球魚類基因條碼計劃(Fish-BOL)中DNA條形碼標準基因COI作為此次研究的條形碼基因，擴增采用擴增魚類COI的引物fishCOI[16](Fish F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；Fish R1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’)，反應體系為50 μL，包含5.0 μL 10×buffer，0.8 μL dNTP(2.5 mmol/L)，正反引物各0.5 μL(50 μmol/L)，0.3 μLTaq酶，DNA模板5 μL，其余用超純水補足。反應條件為94℃預變性5 min；94℃變性60 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工測序。

1.3 序列分析及數(shù)據(jù)處理

利用Chromas 2.33軟件對獲得的序列進行自檢，確定COI基因序列的有效片段長度及準確性并用seqman 7.1.0進行序列拼接；將確定有效的COI基因序列在國際基因庫GenBank數(shù)據(jù)庫和Bold System(Barcode of Life Data System)數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，以確定相似種。結(jié)果均按照《拉漢世界魚類名典》和臺灣魚類資料庫進行同種異名的校正[17]。利用origin 2018畫圖。

2 結(jié)果

2.1 分子鑒定結(jié)果

在L1站位共采得魚卵19枚，仔稚魚201尾；L4站位共采集魚卵17枚，仔稚魚92尾。本研究選取75個魚卵、仔稚魚樣品進行DNA提取、PCR擴增及測序，最終得到魚卵、仔稚魚的COI序列共70條，另有5個魚卵樣品由于可提取的組織過少或DNA降解等原因，使其COI序列擴增失敗。經(jīng)過Bold和Genbank比對，并結(jié)合形態(tài)特征分析共鑒定出26個分類單元，隸屬于8目15科20屬，其中6個鑒定到科，1個鑒定到屬，19個鑒定到種(表1)。

表1 物種名稱、分類地位

續(xù)表1

注：標“+”為在該站位出現(xiàn)，“-”為未出現(xiàn)。

Note：Mark“+”appeared in the station，“-”didn’t appear.

基于K2P模型計算各分類階元的遺傳距離(表2)。種內(nèi)遺傳距離分布在0～0.017之間，平均為0.007；由于樣品較少，鑒定出的結(jié)果基本上1屬內(nèi)只含1個種類，僅舌鰨屬中包含3個種類，屬內(nèi)種間遺傳距離最小為0.216，最大為0.254，平均遺傳距離為0.229；同科屬間遺傳距離最大值為0.313，最小值為0.134，平均值為0.225；同目科間的遺傳距離最小值為0.198，最大值為0.339，平均值為0.268；除同屬種間遺傳距離由于數(shù)據(jù)較少引起一定偏差外，遺傳距離基本上是隨著分類階元的的提高而增大的。

表2 不同分類階元遺傳距離(K2P)統(tǒng)計表

2.2 物種多樣性比較

L1站位魚卵、仔稚魚共14種，其中，魚叚虎魚科種類與數(shù)量最多，共5種，占總數(shù)的71.7%。L1站位物種數(shù)在16日的9：00最多，魚卵仔稚魚共7種，隨后采集到的種類數(shù)呈下降趨勢，18：45之后收集到的樣品種類數(shù)較少，均為4種；L4站位共21種，魚叚虎魚科種類最多，共5種，舌鰨科數(shù)量最多，占總數(shù)的28.8%。L4站位的種類數(shù)在20日21：00達到最大，共10種，隨后采集到的種類數(shù)呈下降趨勢，次日12：00最小，共3種。遠岸站L4總體上物種數(shù)與物種豐富度高于近岸站L1(圖2)。

2.3 潮汐對魚卵、仔稚魚豐度的影響

2.3.1 潮汐對魚卵、仔稚魚總豐度的影響

兩個站位豐度隨潮汐變化不盡相同。近岸站L1站位魚卵、仔稚魚各時間點總豐度變化范圍為0.45～2.80 ind/m3，平均豐度為0.98 ind/m3。在16日落潮時18：45有一個豐度高值，其他時間段豐度變化較??；種類組成上，L1站位每個時間點均有拉式狼牙魚叚虎魚(Odontamblyopuslacepedii)出現(xiàn)，魚叚虎魚科豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢，對于L1站位各時間點豐度的貢獻率為21%～85%，豐度高值點主要是由于魚叚虎魚科種類的迅速增加所貢獻(圖3)。遠岸站L4站位各時間點總豐度變化范圍為0.13～0.88 ind/m3，平均豐度為0.38 ind/m3?？傌S度在20日的21：00達到最大，為0.88 ind/m3，在21日9點總豐度最小，為0.13 ind/m3；豐度與漲落潮的關(guān)系相比L1站位不明顯；L4站位并沒有種類占據(jù)絕對優(yōu)勢，各時間點出現(xiàn)的較為優(yōu)勢的種類都不相同(圖4)。相比遠岸站L4，近岸的L1站位擁有較高的豐度和較低的的物種豐富度。

2.3.2 潮汐對不同生態(tài)習性魚卵、仔稚魚的影響

根據(jù)《浙江海洋魚類志》對魚卵、仔稚魚所對應魚類生態(tài)類群進行劃分[18]。

1)底棲魚類

底棲仔稚魚以魚叚虎魚科為代表。在L1站位，魚叚虎魚科豐度主要由拉式狼牙魚叚虎魚貢獻，其總豐度在9：00低潮時有一個豐度的上升，在16：00-18：00落潮時豐度有一個明顯的高值(圖5a)；L4站位總豐度也有相似的規(guī)律，在20日21：00-0：00落潮時有一個豐度的高值，且出現(xiàn)更多的魚叚虎魚種類；在15：00低潮時，豐度略微上升。L4站位的平均豐度遠小于L1站位，且魚叚虎魚科種類組成差異并不顯著(圖5b)。

注：A：黏皮魚甾魚叚虎魚Mugilogobiusmyxodermus；B：孔魚叚虎魚Trypauchenvagina；C：彈涂魚Periophthalmusmodestus；D：拉式狼牙魚叚虎魚Odontamblyopuslacepedii；E：魚叚虎魚科sp.1 Gobiidae sp.1；F：魚叚虎魚科sp.2 Gobiidae sp.2；G：魚叚虎魚科sp.3 Gobiidae sp.3；H：多須擬矛尾魚叚虎魚Parachaeturichthyspolynema。

2)底層魚類

底層仔稚魚以舌鰨科(Cynoglossidae)、燈籠魚科(Myctophidae)的七星底燈魚(Benthosemapterotum)及發(fā)光鯛科(Acropomatidae)的日本發(fā)光鯛(Acropomajaponicum)為代表。舌鰨科豐度隨潮汐變化較大，16日至17日高、低潮時L1站位的焦氏舌鰨(Cynoglossusjoyneri)豐度較低，而漲潮與落潮時豐度有所上升，16日16：00高潮前后均出現(xiàn)一個豐度的高值，17日3：00高潮前也出現(xiàn)豐度的一個小高值(圖6a)；在L4站位，漲潮時舌鰨科豐度有所上升(圖6b)。燈籠魚科在L1站位的出現(xiàn)頻率明顯小于L4站位，僅在17日21：00低潮時出現(xiàn)(圖7a)；在L4站位豐度較高，于20日21：00落潮起至21日3：00低潮時豐度較高，其他時間點沒有出現(xiàn)或豐度較低(圖7b)。發(fā)光鯛科僅在L4站位20日高潮時采集到1尾(圖8)。

注：A：焦氏舌鰨Cynoglossusjoyneri；B：舌鰨屬Cynoglossussp.。

3)中、下層魚類

中、下層魚類以石首魚科(Sciaenidae)為代表。石首魚科在L1站位豐度高于L4站位，在L1站位分別在16日16：00高潮時和17日3：00高潮時有一個豐度的高值，其中石首魚科sp.與黃姑魚(Nibeaalbiflora)豐度在漲潮時明顯上升，而銀姑魚(Pennahiaargentata)出現(xiàn)頻率較小，僅在16日落潮時發(fā)現(xiàn)(圖9a)；L4站位石首魚科出現(xiàn)頻率小于L1站位，總豐度在20日高潮與0：00落潮時較高，21日9：00高潮時出現(xiàn)豐度的高值(圖9b)，其中石首魚科sp.與黃姑魚在落潮時豐度有所升高，而銀姑魚則在21日0：00落潮時以及21日9：00高潮時采集到。

4)中、上層魚類

中、上層魚類以日本鳀(Engraulisjaponicus)及犀鱈科(Bregmacerotidae)為代表。日本鳀只在L4站位3：00低潮時采集到2尾(圖10)。犀鱈科僅在L4站位采集到，漲潮時豐度相比落潮時要高(圖11)。

注：A：黃姑魚Nibeaalbiflora；B：石首魚科Sciaenidae sp.；C：銀姑魚Pennahiaargentata。

5)魚卵

魚卵缺少自主行動的能力，只能隨水流漂流運動，魚卵隨潮汐的變化并不明顯，在L1站位16日9：00低潮至21：00低潮都有魚卵采集到，其中16：00高潮時豐度最高(圖12a)；L4站位從20日3：00低潮至21日15：00低潮都有魚卵采集到，在21日6：00豐度最高(圖12b)。L4站位的魚卵種類組成明顯高于L1站位，其豐富度高于L1站位。

注：A：單指虎鲉Minousmonodactylus；B：龍頭魚Harpadonnehereus；C：石首魚科Sciaenidae sp.；D：斷線舌鰨Cynoglossusinterruptus；E：焦氏舌鰨Cynoglossusjoyneri；F：高鰭帶魚Trichiuruslepturus；G：少鱗鱚Sillagojaponica；H：虻鲉Erisphexpottii。

3 討論

3.1 COI條形碼進行魚卵、仔稚魚鑒定的適用性和局限性

物種的準確鑒定是魚類浮游生物多樣性與生態(tài)學研究長期以來的瓶頸。目前已鑒別的成魚種類超過28 700余種，但能夠鑒別的仔稚魚種類僅占成魚種類的1/10，而魚卵則不到成魚種類的1/10[12]。DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)在海洋生物多樣性研究中得到廣泛應用[19]。本研究比較各分類階元的遺傳距離，種內(nèi)遺傳距離為0.007，遠小于同屬種間遺傳距離0.229，表明COI序列間的差異能夠很好地區(qū)分各種魚卵、仔稚魚。當然，由于魚類浮游生物特別是魚卵可供甄別的形態(tài)特征較少，其物種的準確鑒定很大程度上依賴DNA條形碼序列的比對結(jié)果，因此數(shù)據(jù)庫的完整性與可靠性對鑒定結(jié)果的準確性至關(guān)重要。本研究中，魚叚虎魚科sp.1(Gobiidae sp.)在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫和Bold系統(tǒng)中比對結(jié)果與小頭副孔魚叚虎魚(Paratrypauchenmicrocephalus)及彈涂魚(Periophthalmusmodestus)相似度最高，但均僅達到92.41%左右，由于結(jié)果中匹配度最高的兩種分屬于不同屬，故只將樣品鑒定到科的水平；魚叚虎魚科sp.2在Genbank數(shù)據(jù)庫中與巴布亞溝魚叚虎魚(Oxyurichthyspapuensis)相似度最大，為90.91%，在Bold系統(tǒng)中匹配度最高的序列也僅定到魚叚虎魚科，故也鑒定至科；魚叚虎魚科sp.3在Genbank數(shù)據(jù)庫中最大相似度為87.6%，在Bold系統(tǒng)中雖然與鈍孔魚叚虎魚屬(Amblyotrypauchensp.)相似度為100%，猜測樣品屬于鈍孔魚叚虎魚屬，但Bold系統(tǒng)中該序列未公開發(fā)表，故仍只將其鑒定到科；另外，魚叚虎魚科有1條序列在兩個數(shù)據(jù)庫與尾斑舌塘鱧(Parioglossusdotui)相似度達100%，與彈涂魚相似度達99.8%，與張順等[20]研究情況相似，鑒于后者在調(diào)查海域分布情況較為常見，故將其鑒定為彈涂魚。此外，有12條序列與兩個數(shù)據(jù)庫中的焦氏舌鰨(Cynoglossusjoyneri)和長吻舌鰨(Cynoglossuslighti)相似度在99%～100%，參考宋超等[21]基于長江口部分舌鰨科(Cynoglossidae)COI基因的研究，長江口的長吻舌鰨和焦氏舌鰨遺傳距離為0.007，可能屬于同種異名，故將其統(tǒng)一鑒定為焦氏舌鰨；舌鰨屬序列在兩個數(shù)據(jù)庫中與紫斑舌鰨(Cynoglossuspurpureomaculatus)和寬體舌鰨(Cynoglossusrobustus)相似度都達到100%，且二者在該海域均有分布記錄，猜測其也存在同種異名的可能，為慎重起見，將其鑒定至屬；6條序列在兩個數(shù)據(jù)庫中，與大黃魚(Larimichthyscrocea)、皮氏叫姑魚(Johniusbelangerii)及鈍頭叫姑魚(Johniusamblycephalus)相似度均達到100%，鑒于大黃魚與皮氏叫姑魚在長江口春、夏季都有出現(xiàn)[22]，故只將其鑒定到科；鳚科1條序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中與短頭跳巖鳚(Petroscirtesbreviceps)和變色跳巖鳚(Petroscirtesvariabilis)達99%以上，在Bold系統(tǒng)中與黑帶稀棘鳚(Meiacanthusatrodorsalis)相似度為100%，故將其鑒定到科。本研究通過條形碼鑒定出的斑點肩鰓鳚仔魚在長江口是首次記錄。徐春燕等[23]曾基于COI基因報道了33種仔稚魚的DNA條形碼分析，其中包括了斑點肩鰓鳚的基因序列；斑點肩鰓鳚分布于印度-太平洋區(qū)，從臺灣北至日本均有分布，但由于其非經(jīng)濟魚類，過去基于形態(tài)學有將其鑒定錯誤的可能，另外，也有斑點肩鰓鳚魚卵隨水流漂至長江口發(fā)育成仔稚魚的可能。

然而，COI基因并非適用于所有魚類的鑒別，某些特定的魚種如魚喜屬(Sillago)、石斑魚科[19]魚類容易發(fā)生雜交現(xiàn)象，僅憑COI基因很難將其鑒定正確，需要與其他基因聯(lián)合標記加以鑒別；此外，由于數(shù)據(jù)庫的不完整，某些魚類僅有16S和12S片段，COI基因尚不能將樣品鑒定至種，對于某些近緣種，需要結(jié)合形態(tài)學、分子遺傳學及地理學才能對其分類并更準確地定位[24]。盡管有上述不足，DNA條形碼因準確性較高、操作簡單，已成為傳統(tǒng)形態(tài)學有力的補充。目前，全球魚類基因條形碼計劃(Fish-BOL)已啟動，我國也加入其中，成魚基因資料庫的不斷完善，勢必推動DNA條形碼在魚類浮游生物鑒定中的應用。

3.2 潮汐對魚類浮游生物的影響

魚卵不具備活動能力，仔稚魚雖然有一定的游泳能力，但游泳能力較弱，二者基本上隨水流漂流生活[25]。潮汐在接近河口時變化非常顯著，漲落潮等大尺度的海水運動必然攜帶海水中的魚卵和仔稚魚進行移動。本研究中，L1和L4站位各時間點間的物種更替率大都超過60%，潮水運動對長江口魚類浮游物種組成影響較大，說明開展河口海域魚類浮游生物多樣性研究必然考慮到潮汐效應。近岸站位L1所采集到的種類數(shù)少于遠岸站L4站位，這與萬瑞景等[26]的研究中魚卵、仔稚魚多樣性在外海高于近海的研究結(jié)果相似；L1站位的豐度相比L4站位卻高得多，這是因為河口區(qū)的環(huán)境變化較為劇烈，能在此棲息的種類多數(shù)具有較好的環(huán)境承受能力和可塑性，因此近河口區(qū)域魚類浮游生物擁有較高豐度的優(yōu)勢種和眾多的稀有種[27-28]。本研究對比潮高和魚卵、仔稚魚種類數(shù)和豐度，發(fā)現(xiàn)潮水的漲落對魚卵、仔稚魚的種類數(shù)影響并不明顯，但對豐度的影響較大。L1站位的豐度總體呈現(xiàn)一種漲潮時降低，落潮時升高的趨勢，而L4站位總豐度隨潮高變化不明顯。依照生態(tài)類群對L1、L4站位的魚卵仔稚魚豐度進行比較后發(fā)現(xiàn)：棲息于咸淡水交匯處的底棲魚類的魚叚虎魚科在落潮時豐度升高，可能是落潮時沖淡水將棲息在河口區(qū)較高豐度的魚叚虎魚帶到了口門外及較靠外海處，魚叚虎魚科對更靠河口的近岸站L1站位豐度貢獻較大，導致L1站位在落潮時豐度上升較為明顯，而遠岸站L4在落潮時魚叚虎魚科豐度也有所上升。底層魚類仔稚魚種類較多，其中舌鰨科在L1站位豐度較高，其豐度與潮汐關(guān)系不明顯，但無論在L1站位還是L4站位，都在高潮前有一個豐度的提高，可推測舌鰨科在該海域分布較為廣泛，漲潮時游泳能力較弱的仔稚魚有隨潮流向近岸移動的趨勢，分布較為集中，密度較大[29]；燈籠魚科的七星底燈魚傾向于分布在高鹽水體[30-32]，其在兩個站位均有出現(xiàn)，且在落潮和低潮時豐度較高，可推測其幼年時期集中在長江口附近發(fā)育，密度較為集中，落潮時由沖淡水攜帶到調(diào)查站位，這與單秀娟等[27]發(fā)現(xiàn)的七星底燈魚幼體主要分布在長江沖淡水與外海水交匯區(qū)結(jié)果相一致。發(fā)光鯛科L4站位出現(xiàn)，呈現(xiàn)漲潮時豐度升高的趨勢，可能是漲潮時隨外海高鹽水團到達調(diào)查站位。中、下層魚類主要為石首魚科，石首魚科在兩個站位的豐度變化較為接近，均在高潮時表現(xiàn)出較高的豐度，石首魚科sp.與黃姑魚在漲潮時豐度明顯上升，可能是石首魚科sp.與黃姑魚分布中心更傾向于深水區(qū)和高鹽水體[30]，在長江口外沿岸分布較廣，漲潮時將較靠外海的個體攜帶至調(diào)查站位；而同科的銀姑魚在夏季偏好鹽度低的水域[31]，因而落潮時出現(xiàn)頻率要高于漲潮時。中、上層魚類以日本鳀和犀鱈科為主，日本鳀僅在L4站位落潮時采集到，日本鳀早期階段適應溫鹽較廣，且長江口一直以來都是鳀、小公魚等經(jīng)濟魚類的育幼場，王小谷等[30]的研究表明夏季長江口鳀魚密集區(qū)域是長江口內(nèi)，因此本文中落潮時鳀魚豐度升高可能是集中于長江口某處的日本鳀魚群隨潮流到達調(diào)查站位；犀鱈科在L4站位出現(xiàn)，呈現(xiàn)漲潮時豐度升高的趨勢，極可能是漲潮時隨外海高鹽水團到達調(diào)查站位。