尹曉玲 火子榕 嚴(yán)爽 張治華

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(上海200029)

2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所(上海200029)

3上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海200029)

前庭神經(jīng)鞘膜瘤（Vestibular schwannoma,VS）是內(nèi)聽道及橋小腦角最為常見的良性腫瘤（約占80～90%），瘤體增大壓迫顱內(nèi)重要血管、神經(jīng)及小腦、腦干導(dǎo)致耳聾、耳鳴、眩暈，嚴(yán)重者更可出現(xiàn)顱高壓、偏癱，甚至威脅生命[1，2]（圖1）。絕大多數(shù)VS為散發(fā)性（約95%），小部分屬于神經(jīng)纖維瘤?、蛐停∟eurofibromatosis type2,NF2），后者以雙側(cè)VS為典型特征，手術(shù)切除是主要治療手段，但同時(shí)也易造成顱神經(jīng)及顱內(nèi)重要血管的不可逆損傷，導(dǎo)致面癱、聽力喪失等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，對(duì)于生物學(xué)行為多變的部分聽神經(jīng)瘤患者(如立體定向放射治療后復(fù)發(fā)者、手術(shù)不耐受患者等)行手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)較大[3]，因此對(duì)聽神經(jīng)瘤非侵入性治療的研究具有重要意義。

近年來(lái)作為腫瘤免疫治療新靶點(diǎn)的程序性死亡蛋白-1（PD-1）通路抑制劑引起了廣泛關(guān)注。作為免疫檢查點(diǎn)家族的成員，T細(xì)胞上的PD-1能與腫瘤細(xì)胞上程序性死亡蛋白配體-1（PD-L1）相結(jié)合抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)并幫助腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[4，5]。大量研究已證實(shí)PD-L1的高表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)[6]。使用PD-1和PD-L1抑制劑，可下調(diào)對(duì)T細(xì)胞的抑制性作用，使T細(xì)胞重獲免疫殺傷功能，目前FDA批準(zhǔn)抗PD1和抗PD-L1抗體治療藥物用于越來(lái)越多的癌癥，包括結(jié)腸癌、直腸癌，膀胱癌，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤等[7]。PD-1/PD-L1表達(dá)在前庭神經(jīng)鞘膜瘤發(fā)生發(fā)展方面研究相對(duì)較少。最近的研究已經(jīng)證實(shí)，與正常顱神經(jīng)組織相比，散發(fā)性VS組織中的促炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及白細(xì)胞粘附分子（ALCAM）表達(dá)均上調(diào)[8]，de Vries M[10]等證實(shí)在快速生長(zhǎng)的散發(fā)性VS中M2型巨噬細(xì)胞和微血管密度顯著升高，腫瘤巨噬細(xì)胞的表達(dá)與腫瘤大小和腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)呈顯著正相關(guān)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CS)及IL-34（可調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子）在散發(fā)性VS中均有表達(dá)，且在生長(zhǎng)迅速及發(fā)生囊性變的VS中表達(dá)更高[9]，這些觀察結(jié)果共同暗示T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在散發(fā)性VS的腫瘤免疫微環(huán)境中起重要作用，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可能是靶向治療VS的新策略，本次研究我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色闡明了PD-L1在散發(fā)性VS組織中的蛋白表達(dá)，通過(guò)評(píng)估CD8+腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（Tumor infiltrating lymphocyte，TIL）表達(dá)密度，進(jìn)一步探究散發(fā)性VS的CD8+TIL相關(guān)的腫瘤免疫微環(huán)境。

圖1 典型前庭神經(jīng)鞘膜瘤影像學(xué)資料。A:T1加權(quán)像水平位示混雜低密度影；B:T2加權(quán)像水平位示多灶高密度影。Fig.1 Imaging data of typical vestibular schwannomas.A:T1 weighted image horizontal position shows mixed low density shadow;B:T2 weighted image horizontal position shows multi-focal high density shadow

1 材料與方法

1.1 病例收集

收集2018年11月至2019年4月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)治療的散發(fā)性VS患者15例，排除神經(jīng)纖維瘤?、蛐?、立體定向放射治療或手術(shù)治療后復(fù)發(fā)患者，所有患者臨床診斷均依據(jù)內(nèi)聽道增強(qiáng)MRI中的特征性表現(xiàn)，術(shù)后常規(guī)病理結(jié)果為最終確診依據(jù)。所有標(biāo)本均取自手術(shù)切除5分鐘之內(nèi)的新鮮腫瘤組織，取下后腫瘤組織分別置于盛有4%多聚甲醛的EP管中固定。

1.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)

取經(jīng)4%多聚甲醛固定后的腫瘤樣本進(jìn)行石蠟包埋，分別切片，厚度為5μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化。對(duì)切片用0.01mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行經(jīng)抗原修復(fù)后使用免疫組化試劑盒（武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，CD8、及PD-L1（SP142）抗體均購(gòu)自上海愛博抗生物公司，并按照1:50比例稀釋，4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗（濃度為1:100），37℃孵育30分鐘，DAB顯色15min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明樹脂封片，光鏡下觀察、拍照。目前PD-L1在前庭神經(jīng)鞘膜瘤中的陽(yáng)性閾值及判讀方法尚未明確，綜合各文獻(xiàn)的研究方法[10,11]，細(xì)胞膜或胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)率＜5%為陰性表達(dá)，＞5%且≤20%為低表達(dá)，＞20%為高表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（high power field，HPF）。排除不在腫瘤背景中出現(xiàn)的免疫陽(yáng)性細(xì)胞（例如血管周圍出血區(qū)域）或假陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域。對(duì)于CD8淋巴細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)HPF，計(jì)算CD8陽(yáng)性個(gè)數(shù)絕對(duì)值[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件，連續(xù)型變量用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量用頻數(shù)（%）表示，連續(xù)型正態(tài)分布變量采用Fisher精確概率檢驗(yàn)，非參數(shù)檢驗(yàn)按實(shí)際情況采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用單因素方差分析方法逐一將各臨床特征及CD8陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)與PD-L1表達(dá)，相關(guān)性分析探究臨床資料與組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果之間關(guān)系，以P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

納入研究的15例患者中，男性7例(46.7.0%)，女性8例(53.3%)。年齡28～62歲，平均年齡（44.3±10.9）歲。所有患者臨床診斷均依據(jù)內(nèi)耳道增強(qiáng)MRI特征性表現(xiàn)，術(shù)中病理結(jié)果為最終確診依據(jù)。腫瘤大小以影像學(xué)橋小腦角區(qū)域最大直徑表示，本研究根據(jù)吳皓等[13]聽神經(jīng)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將腫瘤分為5級(jí)。15例患者腫瘤直徑7.0～36.0mm，平均(17.3±7.5)mm。全部患者術(shù)前常規(guī)行聽力學(xué)檢查，包括聲導(dǎo)抗、純音聽力測(cè)定及言語(yǔ)識(shí)別率等，聽力水平根據(jù)美國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會(huì)(American Academy of Otolaryngology Head and Neck Surgery，AAOHNS)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)[14]。術(shù)前聽力水平A～D級(jí)者分別為3例(20%)、6例(40%)、5例(33.3%)和1例(16.7%)。面神經(jīng)功能評(píng)估采用House Brackmann(HB)分級(jí)，囊性聽神經(jīng)瘤2例(13.3%)（見表1）。

表1 患者基本資料總結(jié)Table 1 Patient characteristics

2.2 PD-L1表達(dá)與臨床特征及CD8+細(xì)胞個(gè)數(shù)的相關(guān)性

腫瘤細(xì)胞膜上的PD-L1表達(dá)已被認(rèn)為是與抗PD-1/抗PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑治療相關(guān)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[15]。PD-L1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞及其間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)上，PD-L1膜染色陽(yáng)性率＞5%定義為陽(yáng)性表達(dá)，＞5%且≤20%為低表達(dá)，＞20%為高表達(dá)，基于形態(tài)學(xué)鑒定腫瘤細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)在14例（93.3%）的散發(fā)性VS組織切片中觀察到陽(yáng)性表達(dá)，其中7例（46.7%）為高表達(dá)（圖2），這些數(shù)據(jù)表明PD-L1在散發(fā)性VS中特異性表達(dá)。研究證明具有CD8淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療有較好的反饋[16]。我們?cè)?5例（100%）的散發(fā)性VS樣本中CD8均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，CD8+細(xì)胞個(gè)數(shù)與PD-L1表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。進(jìn)一步分析PD-L1表達(dá)與各臨床特征包括年齡、性別、腫瘤大小分級(jí)、首發(fā)癥狀、側(cè)別、囊性變、術(shù)前聽力分級(jí)及術(shù)后面神經(jīng)功能都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

圖2 光鏡下前庭神經(jīng)鞘膜瘤組織中PD-L1及CD8淋巴細(xì)胞表達(dá)，免疫組化(低倍鏡×100及高倍鏡×400)。A～B分別為CD8淋巴細(xì)胞在前庭神經(jīng)鞘膜瘤中陰性表達(dá)及陽(yáng)性表達(dá)；C～D分別為PD-L1的陰性表達(dá)及陽(yáng)性表達(dá)。Fig.2 PD-L1 and CD8 lymphocyte expression in vestibular schwannomas under light microscopy,immunohistochemistry(× 100 and × 400).A～B was negatively expressed and positively expressed in vestibular schwannoma respectively;C～D was negative expression and positive expression of PD-L1 respectively.

2.3 PD-L1表達(dá)與CD8+淋巴細(xì)胞的相關(guān)性

我們發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性VS組織切片中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)和CD8+TIL密度之間皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.82，存在顯著正相關(guān)，PD-L1陽(yáng)性腫瘤中CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)水平較PD-L1表達(dá)陰性的組織高（表3）。該結(jié)果更進(jìn)一步闡明了細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)在散發(fā)性VS的腫瘤免疫微環(huán)境中起重要作用。

表2 PD-L1表達(dá)與臨床特征及CD8+個(gè)數(shù)相關(guān)性Table 2 The correlation of PD-L1 expression with clinical characteristic and CD8+number

表3 CD8+淋巴細(xì)胞密度與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis between CD8+lymphocyte density and PD-L1 expression

3 討論

免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控的作用，而免疫逃逸是指通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞的免疫原性或通過(guò)改變隨后的炎癥反應(yīng)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[17]。參與免疫編輯的一類蛋白質(zhì)如B7-H1、B7-H1是PD-1的配體，PD-1是在T細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)的Ig超家族的跨膜受體[18]。在既往的研究中，Archibald DJ[18]等通過(guò)在其收集的48個(gè)散發(fā)性前庭神經(jīng)鞘膜瘤組織中發(fā)現(xiàn)81%樣本B7-H1表達(dá)陽(yáng)性，且在立體定向放射治療失敗后通過(guò)手術(shù)切除的腫瘤中呈現(xiàn)較高表達(dá)，提示免疫逃避可能在散發(fā)性VS的持續(xù)生長(zhǎng)中起一定作用。免疫檢查點(diǎn)PD-L1/PD-1軸的阻斷可以重新激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞以識(shí)別和消除腫瘤細(xì)胞。Shiyang Wang[19]等人檢測(cè)了NF1相關(guān)腫瘤（10例皮膚和6例神經(jīng)纖維瘤）和NF2相關(guān)腫瘤（10例腦膜瘤和10例神經(jīng)鞘膜瘤）組織中 PD-L1（克隆SP142和E1L3N），CD3，CD20，CD8和CD68的表達(dá)，研究結(jié)果表明，細(xì)胞免疫在NF1和NF2相關(guān)腫瘤的腫瘤免疫微環(huán)境中起主要作用，PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)和TIL的存在表明這些腫瘤可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療有反應(yīng)。

TIL是一類浸潤(rùn)到腫瘤細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等具有特異性殺傷腫瘤功能的細(xì)胞。CD8+T淋巴細(xì)胞，又稱為細(xì)胞毒T細(xì)胞，在機(jī)體識(shí)別抗原后能夠?qū)в邢鄳?yīng)抗原的細(xì)胞發(fā)揮特異性殺傷作用，是機(jī)體發(fā)揮腫瘤免疫作用的主要成分[20]。多項(xiàng)研究表明腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量越多，患者使用PD-L1抗體的治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)性更好[21，22]。這意味著PD-L1在腫瘤組織中的預(yù)測(cè)作用在有激活的T細(xì)胞反應(yīng)情況下更可信。

在本研究中，我們研究了散發(fā)性VS腫瘤中PD-L1及CD8+TIL的表達(dá)，且PD-L1表達(dá)與CD8+TIL表達(dá)呈正相關(guān)。盡管PD-L1較多報(bào)道在惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，散發(fā)性VS作為良性腫瘤，也高表達(dá)PD-L1，這一發(fā)現(xiàn)也提示我們PD-L1可能參與調(diào)節(jié)該腫瘤的免疫逃逸，該腫瘤可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療有反應(yīng)，在未來(lái)臨床試驗(yàn)中可進(jìn)一步探索。本研究目前主要分析討論P(yáng)D-L1在散發(fā)性VS組織中的高表達(dá)及與TIL的表達(dá)關(guān)系，這一結(jié)果提示散發(fā)性VS患者可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療有反應(yīng)，由于正常前庭神經(jīng)組織較難獲取，今后還會(huì)完善相關(guān)倫理工作增加正常對(duì)照組研究，并擴(kuò)大腫瘤組織樣本量進(jìn)一步分析，也為今后指導(dǎo)藥物治療散發(fā)性前庭神經(jīng)鞘膜瘤提供更大價(jià)值。