謝景，唐雪陽(yáng)，郝婧，鐘燦，劉浩，黃建華*，張水寒，唐正平，3

1.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，湖南 瀏陽(yáng) 410331

百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神功效，是湖南省重要的食用、藥用中藥材，同時(shí)也是國(guó)家衛(wèi)生部審批通過(guò)的第一批藥食兩用資源。我國(guó)百合種類(lèi)約47種，18個(gè)變種，占世界百合總數(shù)50%以上，其分布橫跨亞熱帶、暖溫帶、溫帶等氣候型，范圍極廣?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，百合藥材為卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker或細(xì)葉百合L. pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗片，其中卷丹、百合是百合藥材種植的主要品種[1]。百合藥材種植范圍較廣，不同產(chǎn)地藥材品質(zhì)差異較大[2-5]，特定的生態(tài)氣候環(huán)境是百合藥材形成的重要外在因素，與百合藥材品質(zhì)的形成密切相關(guān)。以往人們對(duì)百合藥材研究大多集中于含量測(cè)定、藥效研究等方面，對(duì)百合藥材的氣候環(huán)境特征及其與主要化學(xué)含量的相關(guān)性較少。本研究以百合藥材為對(duì)象，采用聚類(lèi)分析、主成分分析、相關(guān)性計(jì)算等統(tǒng)計(jì)方法，開(kāi)展不同產(chǎn)地百合藥材浸出物、總多糖、王百合苷含量與氣候生態(tài)因子的相關(guān)性研究，為百合藥材合理規(guī)劃布局、引種栽培及資源可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.1.2試藥 王百合苷C(純度：99.9%，批號(hào)：P20D10F106515)、王百合苷E(純度：99.2%，批號(hào)：P08J11F107953)、王百合苷B(純度：99.6%，批號(hào)：P28S10F99182)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)Merck公司)；純凈水(華潤(rùn)怡寶飲料有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.1.3樣品 從湖南、江西、貴州等省收集百合藥材樣品共25份，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，15批樣品為卷丹LiliumlancifoliumThunb.、10批為百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker。采用手持全球定位系統(tǒng)(GPS)獲取采樣點(diǎn)的海拔、經(jīng)度、緯度信息(見(jiàn)表1)。

表1 百合藥材樣品信息

1.2 方法

1.2.1采樣點(diǎn)氣候因子收集 從中國(guó)氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)中查詢采樣點(diǎn)近5年(2014—2018年)氣候因子數(shù)據(jù)，包括年平均溫度(℃)、最高氣溫(℃)、平均最低氣溫(℃)、平均最高氣溫(℃)、年平均降水量(mm)、降水量≥0.1 mm日數(shù)(d)、最大日降水量(mm)、平均水氣壓(hPa)、平均相對(duì)濕度(%)、日照時(shí)數(shù)(h)。

1.2.2化學(xué)成分測(cè)定 浸出物含量測(cè)定按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版水溶性浸出物測(cè)定法(通則2201)項(xiàng)的冷浸法測(cè)定?？偠嗵呛坎捎谜樟蛩?蒽酮法測(cè)定，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。采用HPLC測(cè)定王百合苷(王百合苷B、王百合苷C、王百合苷E三者總和)含量，采用Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%～13%A；2～17 min，13%～15%A；17～37 min，15%～20%A；37～42 min，20%～100%A；42～47 min，100%～5%A)；流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。方法學(xué)考察結(jié)果顯示精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析方法

1.2.3.1氣候因子、化學(xué)成分間相關(guān)性分析方法 采用主成分分析方法提取氣候因子和化學(xué)成分的公因子，并以四次方最大值法(Quartimax)旋轉(zhuǎn)后得到因子載荷量及方差貢獻(xiàn)率。以公因子的得分圖比較產(chǎn)地、樣本間的關(guān)系，以因子載荷量評(píng)價(jià)各因素間相關(guān)性。因子載荷量的值越大，說(shuō)明該因子與公因子的相關(guān)性越強(qiáng)，即該因子對(duì)公因子的貢獻(xiàn)也越大。

1.2.3.2百合化學(xué)成分與氣候因子相關(guān)性分析 采用相關(guān)分析、主成分分析等統(tǒng)計(jì)方法，開(kāi)展25個(gè)產(chǎn)地不同品種百合浸出物、總多糖、王百合苷含量與產(chǎn)地氣候因子的相關(guān)分析，分析百合、卷丹品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)與生態(tài)因子之間的相關(guān)性，找出關(guān)鍵的氣候因子，解析氣候因子對(duì)百合藥材品質(zhì)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果和主成分分析

卷丹、百合樣品的浸出物、總多糖、王百合苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2～3，卷丹、百合不同產(chǎn)地間浸出物、總多糖、王百合苷含量差異較大。卷丹浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為22.47%、25.76%、0.202%，RSD分別為45.21%、8.61%、46.98%；百合浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為25.86%、29.04%、0.131%，RSD分別為37.34%、13.82%、87.07%。百合浸出物、總多糖含量高于卷丹，而王百合苷含量低于卷丹。

表2 15批卷丹藥材浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

表3 10批百合藥材浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

對(duì)25份百合藥材樣品浸出物、總多糖及王百合苷3個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行主成分分析(見(jiàn)圖1)。橫軸PC1和縱軸PC22個(gè)主成分貢獻(xiàn)率累計(jì)為82.17%，表明2個(gè)主成分能夠充分體現(xiàn)出百合樣品化學(xué)成分基本特征和主要信息。由圖1可知，10批百合樣品較為分散，說(shuō)明不同產(chǎn)地間百合藥材品質(zhì)差異相對(duì)較大，百合藥材品質(zhì)受產(chǎn)地因素影響相對(duì)較大；15批卷丹樣品更為聚集，說(shuō)明不同產(chǎn)地間卷丹藥材品質(zhì)差異相對(duì)較小，卷丹藥材品質(zhì)受產(chǎn)地因素影響相對(duì)較小。

圖1 不同產(chǎn)地百合藥材化學(xué)成分主成分分析

2.2 產(chǎn)地氣候生態(tài)環(huán)境因子分析與主成分分析

構(gòu)建百合采樣地氣候特征因子，包括X1：最高氣溫(℃)、X2：年平均降水量(mm)、X3：年平均溫度(℃)、X4：平均水氣壓(hPa)、X5：平均相對(duì)濕度(%)、X6：平均最低氣溫(℃)、X7：平均最高氣溫(℃)、X8：降水量≥0.1 mm日數(shù)(d)、X9：日照時(shí)數(shù)(h)、X10：最大日降水量(mm)。將溫度、水分、光照3類(lèi)氣候特征因子數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0軟件，運(yùn)用Person相關(guān)分析方法，分析百合藥材各產(chǎn)地氣候因子的相關(guān)性(見(jiàn)表4)。可知，降水量與平均水氣壓、平均相對(duì)濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，平均氣溫與平均水氣壓、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，日照時(shí)數(shù)與平均水氣壓、平均相對(duì)濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表4 產(chǎn)地氣候生態(tài)環(huán)境因子相關(guān)性

主成分分析法通過(guò)從氣候特征中提取公因子，根據(jù)特征根的大小和每個(gè)因子對(duì)方差解釋的大小來(lái)決定主因子的個(gè)數(shù)，通常前3個(gè)主成分就能夠體現(xiàn)所有特征的信息。從表5中可知，前3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到91.99%，幾乎包含了原有氣候因子的特征信息。進(jìn)而，利用主成分分析的得分進(jìn)行作圖來(lái)體現(xiàn)各因子間的相似性，見(jiàn)圖2。從圖中可見(jiàn)，百合、卷丹產(chǎn)地氣候因子主成分分析結(jié)果存在較大差異，百合和卷丹產(chǎn)地氣候因子各自聚為一類(lèi)，而卷丹更為緊湊，百合則相對(duì)分散，說(shuō)明百合受不同產(chǎn)地環(huán)境影響較大，產(chǎn)地氣候環(huán)境要求更高。

表5 主成分分析方差總解釋

圖2 百合氣候因子主成分分析

經(jīng)方差最大旋轉(zhuǎn)后的因子載荷系數(shù)矩陣見(jiàn)表6。因子載荷系數(shù)的值越大，說(shuō)明該因子與公因子的相關(guān)性越強(qiáng)，該因子在公因子的貢獻(xiàn)也就越大。

表6 各氣候因子的載荷分析結(jié)果

第一公因子中，因子載荷量較大的變量分別是主要與溫度及相關(guān)的因子，包括最高氣溫、平均溫度、平均水氣壓、平均最低氣溫、平均最高氣溫，可見(jiàn)氣候因子中溫度因素是這些因素的主要因素，稱第一共因子為“溫度因子”。

第二、三公因子中，因子載荷較大的變量是與水分及相關(guān)的因子，包括年平均降水量、平均相對(duì)濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量。因此，稱第二和第三公因子為“降水因子”。

2.3 百合藥材化學(xué)成分與氣候因子相關(guān)性分析

對(duì)氣候因子與卷丹浸出物、多糖含量、王百合苷含量的總和進(jìn)行相關(guān)性分析。從表7中可見(jiàn)，卷丹浸出物、多糖含量與溫度氣候因子最相關(guān)。卷丹多糖含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈現(xiàn)正相關(guān)，r分別為0.458 7、0.464 3、0.391 3、0.539 4；與年平均降水量、平均相對(duì)濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量呈負(fù)相關(guān)，其中與平均相對(duì)濕度達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。卷丹浸出物含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，r為0.309 6、0.549 9、0.546 9、0.577 2，說(shuō)明氣候環(huán)境溫度越高反而不利于卷丹浸出物含量積累。王百合苷含量與各氣候因子整體呈現(xiàn)正相關(guān)，與降水量相關(guān)性較大。

表7 卷丹浸出物、總多糖、王百合苷與氣候因子相關(guān)性

對(duì)氣候因子與百合浸出物、多糖含量、王百合苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析。從表8中可見(jiàn)，百合各成分指標(biāo)與氣候因子的相關(guān)性與卷丹類(lèi)似，但是相關(guān)性更顯著。百合總多糖含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈正相關(guān)，r分別為0.635 6、0.503 2、0.485 2、0.926 9；與年平均降水量、平均相對(duì)濕度呈負(fù)相關(guān)，與卷丹結(jié)果一致。浸出物含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈正相關(guān)，與卷丹結(jié)果相反，r分別為0.666 1、0.964 0、0.998 0、0.610 5。百合王百合苷含量與各氣候因子整體呈現(xiàn)正相關(guān)，結(jié)果與卷丹一致。

表8 百合浸出物、總多糖、王百合苷與氣候因子相關(guān)性

3 討論

不同產(chǎn)地百合和卷丹藥材浸出物、總多糖、王百合苷含量存在較大差異。研究結(jié)果表明，百合浸出物、總多糖含量高于卷丹，王百合苷含量低于卷丹。歷代文獻(xiàn)描述百合“味甘美可食，粉性足，味道甘甜”品質(zhì)較佳[7]，與本研究結(jié)果一致。傳統(tǒng)認(rèn)為，卷丹“根味頗苦”，與百合相異，文獻(xiàn)報(bào)道這種“苦味”可能與皂苷類(lèi)成分有關(guān)[8]。

產(chǎn)地氣候環(huán)境對(duì)卷丹和百合的浸出物、總多糖、王百合苷含量影響均存在顯著差異。溫度因子如最高氣溫、平均溫度、平均水氣壓、平均最低氣溫、平均最高氣溫影響較大，與百合總多糖含量呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在一定溫度范圍內(nèi)，百合類(lèi)植物除可溶性蛋白含量外其他生理生化指標(biāo)(包括水溶性糖類(lèi))隨處理溫度的升高而逐漸上升，但溫度過(guò)高對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育不利[9]。百合活性成分以糖類(lèi)等初級(jí)代謝產(chǎn)物為主，高溫氣候可能通過(guò)提高植物生理生化指標(biāo)而促進(jìn)糖類(lèi)成分積累，提高藥材品質(zhì)。

水分因子如年平均降水量、平均相對(duì)濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量影響次之，總多糖含量與年平均降水量、平均相對(duì)濕度呈負(fù)相關(guān)。有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，百合植株適宜在輕度干旱脅迫條件下生長(zhǎng)，但嚴(yán)重干旱不利于植株生長(zhǎng)[10-11]。雨水較多的氣候環(huán)境容易引發(fā)病害，影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育造成藥材品質(zhì)下降，這可能是降水量及相關(guān)因子是影響百合品質(zhì)形成的原因所在。

本研究揭示了影響百合藥材浸出物、總多糖、王百合苷含量積累的主要生態(tài)因子是溫度和水分，高溫氣候有利于優(yōu)質(zhì)藥材的形成。傳統(tǒng)認(rèn)為，湖南邵陽(yáng)地區(qū)所產(chǎn)百合片形狹長(zhǎng)、兩端漸尖、色白肉厚，冠以“龍牙百合”之名，是歷代認(rèn)為品質(zhì)最佳的百合道地藥材。湖南龍山地區(qū)所產(chǎn)卷丹又稱“龍山百合”，色雪白而略帶苦味，是湖南省百合藥材種植的主流品種[12]，也頗負(fù)盛名。湖南地區(qū)6—8月夏季高溫，有利于百合藥材多糖類(lèi)成分積累，而湖南隆回、龍山地區(qū)海拔相對(duì)較高，土壤沙性且病蟲(chóng)害防治技術(shù)成熟，對(duì)“龍牙百合”“龍山百合”品牌的形成提供了外部生態(tài)環(huán)境。在百合種植生產(chǎn)過(guò)程中，除要科學(xué)考察適宜的種植生態(tài)環(huán)境外，還要有合理科學(xué)的種植及產(chǎn)地加工技術(shù)，才能確保生產(chǎn)出道地優(yōu)質(zhì)藥材。