常永杰 周佳佳 張麗紅 孟佑廉 高澤霞 ,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070;2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 3. 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

魚(yú)類的肌間骨(Intermuscular bone, IB)又名肌間刺或肌間小骨, 是位于脊椎骨兩側(cè)肌隔中的硬骨小刺, 由肌隔結(jié)締組織骨化而成的硬骨, 且通過(guò)結(jié)締組織連在其他骨骼上[1—4]。目前被認(rèn)知的魚(yú)類肌間骨類型包括三類, 髓弓小骨、椎體小骨和脈弓小骨[5]。我國(guó)大宗淡水魚(yú)類普遍存在肌間骨, 對(duì)人類的食用、出口和深加工造成很大困擾, 嚴(yán)重影響了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。

近年來(lái)有關(guān)魚(yú)類肌間骨的研究大多集中在肌間骨的數(shù)目及形態(tài), 如國(guó)外Patterson和Johnson[5]對(duì)125屬真骨魚(yú)代表種的肌間骨進(jìn)行了詳細(xì)的觀察和分析。國(guó)內(nèi)對(duì)肌間骨形態(tài)學(xué)的研究集中于鯉科魚(yú)類, 董在杰等[7]對(duì)鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)和異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的肌間骨進(jìn)行了初步的探究; 柯中和等[8]、萬(wàn)世明等[3]、陳琳等[4]分別對(duì)鰱、團(tuán)頭魴和黃河鯉(Cyprinus carpio haematopterus)肌間骨發(fā)育的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了觀察。呂耀平等[9]對(duì)骨舌魚(yú)總目、海鰱總目、鯡形總目和骨鰾總目等共計(jì)14種低等真骨魚(yú)類的肌間骨形態(tài)學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)研究, 認(rèn)為肌間骨的形態(tài)是由簡(jiǎn)單向復(fù)雜演化, 然后逐漸退化。在肌間骨的發(fā)現(xiàn)和分類上面僅有秉志[1]提及, 現(xiàn)今延用的是Patterson和Johnson[5]的分類標(biāo)準(zhǔn)。

刀鱭(Coilianasus), 隸屬鯡形目(Clupeiformes),鳀科(Engraulidae), 鱭屬(Coilia), 是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚(yú)類[10,11], 其上頜骨較長(zhǎng), 向后延伸達(dá)到胸鰭基部,故又名長(zhǎng)頜鱭。短頜鱭(C.brachygnathus)和刀鱭隸屬于同一屬, 其上頜骨較刀鱭短, 向后延伸不超過(guò)鰓蓋骨。鱭雖然骨刺較多, 但肉嫩味美, 深受人們喜愛(ài)。目前對(duì)鱭屬魚(yú)類, 尤其是刀鱭種群的生物學(xué)參數(shù)、繁殖特征等方面有著大量的研究[12—14], 但針對(duì)鱭屬魚(yú)類肌間骨的研究卻很少提及。本文主要對(duì)刀鱭和短頜鱭肌間骨的分布進(jìn)行觀察, 在人們普遍認(rèn)知的魚(yú)類三種類型肌間骨基礎(chǔ)上, 發(fā)現(xiàn)了另外一種類型肌間骨的存在。此外本文對(duì)刀鱭肌間骨數(shù)目和長(zhǎng)度進(jìn)行研究分析, 作為對(duì)魚(yú)類肌間骨形態(tài)學(xué)研究的補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于骨骼染色的刀鱭體重128 g, 體長(zhǎng)34 cm; 短頜鱭體重45.8 g, 體長(zhǎng)23 cm。形態(tài)解剖刀鱭共10尾,平均體重(49.58±6.16) g, 平均體長(zhǎng)(24.39±4.39) cm。以上用于染色的刀鱭和短頜鱭于2017年8月份從鄱陽(yáng)湖捕撈獲得, 解剖的刀鱭個(gè)體于2018年3月份購(gòu)于江蘇省啟東市連興港碼頭。刀鱭胸鰭上部游離絲狀鰭條5—6枚, 脊椎骨77—82根, 臀鰭甚長(zhǎng), 與尾鰭基相連; 上頜骨游離, 超過(guò)鰓蓋后緣, 延伸至胸鰭基部。短頜鱭基本特征與刀鱭相似, 但其上頜骨較刀鱭短, 向后延伸不超過(guò)鰓蓋骨。因刀鱭和短頜鱭活魚(yú)運(yùn)輸較困難, 所購(gòu)買(mǎi)的實(shí)驗(yàn)魚(yú)均為冰鮮魚(yú)。

1.2 刀鱭物種鑒定

提取刀鱭鰭條組織DNA, 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的刀鱭COⅠ基因序列(GBGCA10305-15; Gen-Bank： KJ710626), 利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PCR引物(COI-F： 5′-TATTTAGTATTCGGT GCCTG-3′; COI-R： 5′-TGCTACTTCTCGTTTGGC-3′), 送至武漢擎科生物技術(shù)公司合成; 以實(shí)驗(yàn)魚(yú)DNA為模板, PCR擴(kuò)增目的基因(COⅠ), 并送至武漢昆泰銳生物公司測(cè)序。PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序后獲得實(shí)驗(yàn)魚(yú)的COⅠ基因序列1304 bp, 與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的刀鱭COⅠ基因序列匹配度高達(dá)99%。結(jié)合捕獲地點(diǎn)和形態(tài)學(xué)特征可確定實(shí)驗(yàn)魚(yú)為刀鱭。

1.3 整體骨骼染色方法

骨骼染色方法在白鳳熙[15]染色方法的基礎(chǔ)上略有改動(dòng), 具體方法如下： (1)無(wú)水乙醇脫水固定1周;(2)將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2% KOH和3% H2O2的混合溶液中漂白3h; (3)將漂白的標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2% KOH溶液中透明; (4)3h后去除鱗片和內(nèi)臟, 繼續(xù)透明(透明時(shí)間以魚(yú)體隱約半透明為佳, 約6h); (5)經(jīng)透明的標(biāo)本轉(zhuǎn)移至新的茜素紅染色液(1 g茜素紅溶于100 mL 1%KOH溶液中配制成染色液), 染色時(shí)間約6h; (6)染好色的標(biāo)本依次在20%、50%和100%甘油進(jìn)行梯度透明。最后對(duì)染色結(jié)果用數(shù)碼相機(jī)(佳能IXUS170)進(jìn)行拍照觀察。

1.4 肌間骨數(shù)目、形態(tài)的觀察和測(cè)定

實(shí)驗(yàn)魚(yú)經(jīng)紗布擦干魚(yú)體后進(jìn)行體重與體長(zhǎng)的測(cè)量。然后用紗布將整條魚(yú)包裹好, 置于沸水中煮10—15min, 取出, 待其自然冷卻后去除紗布, 用鑷子小心剝?nèi)テつw和肌肉, 根據(jù)刀鱭染色結(jié)果來(lái)挑取肌間刺, 并依次從前往后排列, 然后用數(shù)碼相機(jī)(佳能IXUS170)拍照, 并用游標(biāo)卡尺(廣陸0—200, 精度0.01 mm)測(cè)量肌間骨長(zhǎng)度。

1.5 肌間骨組織學(xué)觀察

取刀鱭髓弓小骨、脈弓小骨、背部上方和腹部下方的肌間骨樣品(包含骨組織周圍的結(jié)締組織)于4%多聚甲醛固定, 并進(jìn)行后續(xù)的組織學(xué)分析。固定后的樣品于雙蒸水中漂洗后轉(zhuǎn)于EDTA脫鈣液(谷歌生物公司)中進(jìn)行脫鈣處理, 在室溫下肌間骨脫鈣12h; 脫鈣完成后將樣品進(jìn)行一系列脫水處理后用石蠟進(jìn)行組織包埋, 并進(jìn)行連續(xù)切片(5 μm);將切片于二甲苯中脫蠟透明、梯度酒精復(fù)水后將其分成兩份, 分別進(jìn)行茜素紅染色和阿利新藍(lán)染色。其中茜素紅染色過(guò)程為： 將切片放于茜素紅染液中浸染5min, 自來(lái)水洗去切片浮色后轉(zhuǎn)置于60℃烘箱烘片30min, 烘片結(jié)束后于二甲苯透明, 最后中性樹(shù)脂封片; 阿利新藍(lán)染色過(guò)程為： 阿利新藍(lán)染液中浸染15min, 置于水中洗去浮色后轉(zhuǎn)置于核固紅復(fù)染5min, 依次對(duì)切片進(jìn)行水洗、二甲苯透明處理, 最后用中性樹(shù)脂封片。

2 結(jié)果

2.1 肌間骨形態(tài)及分布

對(duì)刀鱭和短頜鱭整體骨骼染色結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn),刀鱭和短頜鱭不僅有髓弓小骨、脈弓小骨和椎體小骨, 在其背部上方和腹部下方也存在肌間骨, 分別存在于背部上方和腹部下方肌膈的皺褶部(圖1)。解剖后觀察顯示刀鱭肌間骨的形態(tài)有“1”形、“卜”形、“y”形、一端多叉形和“(”形5種類型。髓弓小骨和脈弓小骨的形態(tài)較復(fù)雜, 主要有“1”形、“y”形、“卜”形, 少量“(”形和“一端多叉”形(圖2); 椎體小骨的形態(tài)僅有“1”形; 背部上方肌間骨形態(tài)簡(jiǎn)單,多數(shù)為“(”形, 分布于背鰭下方至尾鰭處; 腹部下方肌間骨多為“1”形, 少數(shù)是“(”形, 分布于肛門(mén)至尾鰭處; 背部上方和腹部下方肌間骨較其他部位的肌間骨短而細(xì)(圖2)。

2.2 肌間骨的數(shù)目和長(zhǎng)度

刀鱭的肌間骨的數(shù)目見(jiàn)表1。個(gè)體肌間骨總數(shù)范圍為492—543, 平均為521; 左側(cè)肌間骨范圍為233—274, 平均為256; 右側(cè)肌間骨范圍為239—301, 平均為265; 左右兩側(cè)肌間骨數(shù)目差異不顯著(P＞0.05)。背部上方肌間骨、椎體小骨、腹部下方肌間骨與髓弓小骨和脈弓小骨在數(shù)目上存在顯著差異(P＜0.05), 背部上方肌間骨、椎體小骨、腹部下方肌間骨三者之間數(shù)目差異顯著(P＜0.05), 髓弓小骨與脈弓小骨數(shù)目差異不顯著(P＞0.05)。

刀鱭各種類型肌間骨的長(zhǎng)度如表2所示。背部上方肌間骨的長(zhǎng)度為(1.44±0.16) cm; 髓弓小骨的長(zhǎng)度為(2.09±0.24) cm; 椎體小骨的長(zhǎng)度為(1.02±0.17) cm;脈弓小骨的長(zhǎng)度為(2.13±0.19) cm; 腹部下方肌間骨長(zhǎng)度為(1.08±0.12) cm。髓弓小骨和脈弓小骨的長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于背部上方肌間骨(P＜0.05)和腹部下方肌間骨(P＜0.01), 背部上方肌間骨的長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于椎體小骨和腹部下方肌間骨(P＜0.05)。不同部位肌間骨長(zhǎng)度相關(guān)性分析結(jié)果顯示背部上方肌間骨的長(zhǎng)度與腹部下方肌間骨(r=0.744)和髓弓小骨(r=0.762)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05), 髓弓小骨的長(zhǎng)度與腹部下方肌間骨長(zhǎng)度的相關(guān)性極顯著(P＜0.01), 其他部位的肌間骨之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性(表3)。此外, 不同部位的肌間骨與個(gè)體體長(zhǎng)和體重也存在一定的相關(guān)性分析(表4), 其中體長(zhǎng)與脈弓小骨(r=0.967)長(zhǎng)度存在極顯著相關(guān)性(P＜0.01), 體重與脈弓小骨(r=0.742)的相關(guān)性顯著(P＜0.05), 與其他部位肌間骨長(zhǎng)度沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

圖1 刀鱭和短頜鱭整體骨骼染色肌間骨結(jié)果圖Fig. 1 Whole-mount staining of skeleton for intermuscular bones in C. nasus and C. brachygnathus

圖2 刀鱭右側(cè)肌間骨形態(tài)圖Fig. 2 The morphology of IBs in C. nasus

表1 刀鱭肌間骨的數(shù)目Tab. 1 The number of IBs in C. nasus

表2 刀鱭肌間骨的長(zhǎng)度Tab. 2 The length of IBs in C. nasus

2.3 組織學(xué)結(jié)構(gòu)

為了解刀鱭不同部位肌間骨(椎體小骨除外)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及其差異, 本研究采用茜素紅與阿利新藍(lán)兩種染色方法分別對(duì)其切片組織進(jìn)行染色分析,茜素紅可使鈣化結(jié)節(jié)或硬骨組織染成紅色, 阿利新藍(lán)可使軟骨組織、結(jié)締組織染成藍(lán)色。染色結(jié)果顯示刀鱭的背部上方肌間骨(圖版Ⅰ-1—4)、髓弓小骨(圖版Ⅰ-5—8)、脈弓小骨(圖版Ⅰ-9—12)和腹部下方肌間骨(圖版Ⅰ-13—16)均被茜素紅染成紅色, 而阿利新藍(lán)未使肌間骨組織著色, 但其四周結(jié)締組織被染色為藍(lán)色, 表明各種類型的肌間骨均為鈣化的硬骨組織。肌間骨外周結(jié)締組織染色結(jié)果表明在髓弓小骨和脈弓小骨中, 每根肌間骨并不是獨(dú)立存在的, 而是由肌膈等結(jié)締組織連接在一起,形成一個(gè)網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ-7、11); 在背部上方肌間骨(圖版Ⅰ-3)和腹部下方肌間骨(圖版Ⅰ-15)中,各肌間骨之間未發(fā)現(xiàn)明顯互相連接的結(jié)締組織。

3 討論

Patterson和Johnson[5]根據(jù)魚(yú)類肌間骨附著的部位把其分為三類, 包括髓弓小骨、椎體小骨和脈弓小骨。本研究以刀鱭為主要的研究對(duì)象, 魚(yú)體解剖和整體骨骼染色結(jié)果都顯示, 刀鱭除了包含Patterson和Johnson[5]描述的三種肌間骨以外, 還有另外兩種在國(guó)內(nèi)研究中未被提起的背部上方和腹部下方肌間骨的存在。Chapman[16]在鯡科魚(yú)類中也發(fā)現(xiàn)有兩類額外的獨(dú)立肌間骨, 背部分布于除前5—6個(gè)肌節(jié)之外的肌節(jié)中, 腹部分布于從肛門(mén)至尾鰭基部的肌節(jié)中, 這兩類肌間骨都存在于肌膈的皺褶部, 將其統(tǒng)一命名為肌骨桿(Myorhabdoi)。本研究在刀鱭和短頜鱭中發(fā)現(xiàn)的背部上方肌間骨和腹部下方肌間骨與Chapman[16]描述的肌骨桿位置相似, 因此將本研究中發(fā)現(xiàn)的背部上方肌間骨和腹部下方肌間骨定義為背上肌骨桿和腹下肌骨桿。Chapman[16]認(rèn)為這種類型的肌間骨是鯡科魚(yú)類的典型特征, 鳀科魚(yú)類沒(méi)有, 這與本研究發(fā)現(xiàn)的鯡形目鳀科的刀鱭相悖。呂耀平等[9]報(bào)道的刀鱭肌間骨只有三種類型, 未提及背上和腹下肌骨桿的存在,因此其報(bào)道的肌間骨數(shù)目?jī)H有221根, 較本研究的521根少很多。本研究發(fā)現(xiàn)的刀鱭椎體小骨的平均數(shù)目為42根, 這與蔣燕等[17]的44根接近。刀鱭背上和腹下肌間骨類型(統(tǒng)稱肌骨桿)的發(fā)現(xiàn)豐富了國(guó)內(nèi)魚(yú)類肌間骨類型的基礎(chǔ)資料。

表3 刀鱭肌間骨數(shù)目和長(zhǎng)度的相關(guān)性分析Tab. 3 The correlation between IB’s number and IB’s length in C. nasus from different parts

表4 刀鱭體長(zhǎng)體重與肌間骨長(zhǎng)度的相關(guān)性分析Tab. 4 The correlation of IBs’ length with body length and body weight in C. nasus from different parts

關(guān)于魚(yú)類肌間骨的形態(tài)類型, 蘇錦祥等[18]曾把鰱的肌間骨分為4種類型： “1”形、“卜”形、“y”形和樹(shù)枝形。根據(jù)低等真骨魚(yú)類肌間骨形態(tài)的復(fù)雜程度, 呂耀平等[9]為便于分析各種形態(tài)肌間骨演化規(guī)律, 將其歸納為7種類型(“ I”形、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、兩端多叉形、樹(shù)枝形)。萬(wàn)世明等[3]將團(tuán)頭魴肌間骨形態(tài)分為6種形態(tài),分別是“1”形、“卜”形、“y”形、一端多叉形、兩端多叉形、“(”形。董在杰等[7]通過(guò)對(duì)幾種常見(jiàn)的鯉科魚(yú)類肌間骨的研究把其主要?dú)w于兩類： “1”形和“y”形, 其他形態(tài)均是在其基礎(chǔ)上分化的。本文采用萬(wàn)世明等[3]的分類方法, 把刀鱭肌間骨分為從最簡(jiǎn)單的“1”形到最復(fù)雜的一端多叉形在內(nèi)的5種形態(tài)。刀鱭肌間骨形態(tài)的分類研究已有文獻(xiàn)報(bào)道, 但可能由于采取的分類標(biāo)準(zhǔn)不同, 本文對(duì)刀鱭肌間骨的形態(tài)比呂耀平等[9]的分類多出一種“(”形。刀鱭的椎體小骨形態(tài)相較于海鰻(Muraenesox cinereus)和鰣(Tenualosa reevesii)簡(jiǎn)單, 僅有“1”形, 與蔣燕等[17]的研究一致。刀鱭肌間骨解剖結(jié)果可以看出靠近尾部的肌間骨形態(tài)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單, 中間部位的形態(tài)較為復(fù)雜且較兩端長(zhǎng), 這可能與魚(yú)體不同部位的形態(tài)結(jié)構(gòu)及機(jī)體自身的運(yùn)動(dòng)相關(guān)。

肌間骨是由肌隔結(jié)締組織骨化而成的硬骨。本研究各種類型的肌間骨均被茜素紅染成紅色, 而阿利新藍(lán)未使肌間骨組織著色, 但其四周結(jié)締組織被染色為藍(lán)色, 組織學(xué)結(jié)果證實(shí)了刀鱭各種類型的肌間骨均為鈣化的硬骨組織。哺乳動(dòng)物肌膈分化的相關(guān)研究表明, 肌膈中的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為肌腱源性干細(xì)胞, 而肌腱源性干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌腱細(xì)胞[19]。因此, 肌間骨可能是由間充質(zhì)干細(xì)胞首先分化為肌腱源性干細(xì)胞, 之后在肌腱源性干細(xì)胞分化相關(guān)基因的作用下分化為成骨細(xì)胞, 進(jìn)而形成骨細(xì)胞, 最終形成肌間骨, 但其具體的形成機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖版Ⅰ 刀鱭背部上方肌間骨(1—4)、髓弓小骨(5—8)、脈弓小骨(9—12)、腹部下方肌間骨(13—16)組織的茜素紅(1, 2, 5, 6, 9, 10,13, 14)和阿利新藍(lán)(3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16)染色結(jié)果PlateⅠ Histological analysis of different IBs in C. nasus, transverse sections (1-16). transverse sections, stained with Alizarin red (1, 2, 5,6, 9, 10, 13, 14) and Alcian blue (3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16), showing the dorsal IBs (1—4), epineurals (5—8), epipleurals (9—12), ventral IBs (13—16) of C. nasus黑色圓圈為各類肌間骨所在位置, 偶數(shù)字母(2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16)圖片為對(duì)應(yīng)奇數(shù)字母(1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15)圖片中黑色實(shí)心圓圈部位的放大圖The IBs indicated by black circle in odd number (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15) were magnified in even number (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16)