張 依，王文俊，楊安懷

0 引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)又稱為老年性黃斑變性(senile macular degeneration,SMD)，患者多為50歲以上，雙眼先后發(fā)病或同時(shí)發(fā)病，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家患者致盲最主要的原因。由于人口的老齡化，我國(guó)ARMD患者也日益增多[1-2]。目前，根據(jù)臨床表現(xiàn)及病理特征改變的不同可分為兩型：干性老年性黃斑變性(dry senile macular degeneration，dry-SMD)，或稱為非滲出型老年性黃斑變性(nonexudative senile macular degeneration)，或非新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(non-neovascular age-related macular degeneration,non-NAMD)；濕性老年性黃斑變性(wet senile macular degeneration,wet-SMD)，或稱為滲出型老年性黃斑變性(exudative senile macular degeneration)，或新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration,NAMD)[1,3]。

1 NAMD的發(fā)病機(jī)制及致病因子

ARMD是一種多因素的變性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確?？赡芘c遺傳易感性、環(huán)境暴露、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、代謝障礙、視網(wǎng)膜的慢性光損傷等因素有關(guān)。隨著年齡增長(zhǎng)，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)功能障礙，RPE細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)積聚，細(xì)胞外基質(zhì)異常地聚集于基底膜，在RPE層與Brush膜之間聚集形成玻璃膜疣(drusen)，這種聚齊物沿著B(niǎo)rush膜擴(kuò)散增厚，最終光感受器和RPE細(xì)胞逐漸死亡，這一階段的疾病稱為non-NAMD或dry-SMD[1，3]。隨著病變的發(fā)展，大多數(shù)ARMD患者的中心視力進(jìn)行性惡化，這是由于感光細(xì)胞和RPE層細(xì)胞死亡增多，導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部萎縮，稱為地圖樣萎縮。遺傳研究表明，補(bǔ)體介導(dǎo)的炎癥損傷在ARMD的易感性中起著重要的作用[4-6]，但它究竟是如何發(fā)揮作用還不得而知。總的來(lái)說(shuō)，目前對(duì)于non-NAMD的發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有足夠了解，因此無(wú)法確定其治療的發(fā)展路徑。

大約20%的non-NAMD患者由于脈絡(luò)膜和(或)視網(wǎng)膜深層毛細(xì)血管的異常生長(zhǎng)，侵犯視網(wǎng)膜下空間，最終轉(zhuǎn)變?yōu)镹AMD[3]。NAMD是以黃斑下脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成，血管發(fā)生滲漏、出血、水腫，最終形成纖維瘢痕為特點(diǎn)，致使中心視力進(jìn)行性受損的嚴(yán)重致盲性疾病[1,7]。目前認(rèn)為NAMD主要發(fā)病機(jī)制有以下兩點(diǎn)：(1)由于RPE細(xì)胞的應(yīng)激或損傷以及相關(guān)的免疫反應(yīng)促進(jìn)血管內(nèi)皮生成因子(choroidal neovascularization，VEGF)的產(chǎn)生，從而驅(qū)動(dòng)CNV的形成[8]。(2)脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)的退行性改變是促進(jìn)病理性血管生成的另一個(gè)可能的因素。從早期的ARMD患者的檢查可以發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和Sattler層的血管減少和(或)血流灌注的減低，可促使病理性血管的形成。無(wú)癥狀的病理性血管的改變可引起脈絡(luò)膜缺氧及VEGF分泌增多，導(dǎo)致病變血管的形成[7，9-10]。VEGF在新生血管形成、血管滲透增加中發(fā)揮重要的作用。在VEGF家族中，有VEGF A～F六個(gè)成員，其中VEGF-A是動(dòng)物模型和人類NAMD的關(guān)鍵因子[11-12]。臨床觀察表明，玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF-A藥物，抑制了CNV的生成，減少血管的滲漏，顯著地改善了NAMD患者的預(yù)后。因此抗VEGF是治療NAMD的中心環(huán)節(jié)[12-13]。

2 基因治療的發(fā)展背景

目前，臨床上常用抗VEGF藥物治療NAMD，但是隨著大量的臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)這種治療方法，需要頻繁持久的眼內(nèi)注射，增加了治療成本，且容易并發(fā)眼內(nèi)炎、眼壓升高及其他不良事件的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)需要良好的依從性的配合，患者才得以保存中心視力[14]。隨著我國(guó)的人口老齡化，我們迫切需要給NAMD患者提供長(zhǎng)期的治療方案，探索發(fā)展一種具有持續(xù)抗VEGF活性的治療方法，而基因治療為這種治療策略提供了一個(gè)可行的方案。

3 眼部基因治療的特點(diǎn)

基因治療的前提，需要將遺傳物質(zhì)傳遞到宿主細(xì)胞，以糾正功能失調(diào)的基因或編碼成治療蛋白[15]?；蛑委熗ǔａ槍?duì)單因素變性疾病，目前大量臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，基因治療在眼科多因素變性疾病中發(fā)揮作用，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)和ARMD[3,16-17]。

眼睛作為基因治療的靶器官，其優(yōu)勢(shì)有以下幾點(diǎn)：(1)可以進(jìn)行局部治療而不是靜脈注射，可以最大限度地減少基因載體的全身吸收，一旦被感染，眼部免疫相關(guān)機(jī)制會(huì)限制引發(fā)不必要的全身反應(yīng)[18]。(2)由于眼睛體積小，極少量的載體濃度足以達(dá)到基因治療的水平。(3)眼部的局部解剖，顯示出高度的生理分隔，使特定的細(xì)胞群體容易成為治療目標(biāo)。(4)光學(xué)介質(zhì)的透明性使得眼科相關(guān)檢查如視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)、熒光素鈉眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)等易于進(jìn)行評(píng)估[16]。

4 常見(jiàn)的基因治療NAMD的方法

基因治療NAMD可以提供長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)抗VEGF作用的蛋白質(zhì)。這種治療方式中，遺傳信息的傳遞需要病毒作為載體。目前用于眼基因治療的臨床試驗(yàn)中常用的病毒載體包括腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體，即細(xì)小病毒家族的小單鏈DNA病毒，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中的慢病毒(lentiviral,LV)即RNA病毒。這兩類病毒都可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞，但腺病毒及AAV載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞是不整合的，而LV載體可將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，具有更大的轉(zhuǎn)基因能力[13-14]。在成功轉(zhuǎn)染后，靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄并將病毒攜帶的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化為治療蛋白，發(fā)揮治療的作用。

4.1色素上皮衍生因子色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)是一種較強(qiáng)的抗血管生成因子，在內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程中具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[19]。在2006年,Campochiaro等[20]發(fā)布了使用表達(dá)人PEDF的腺病毒載體(AdPEDF.11)進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)(NCT00109499)的結(jié)果。在他們的多中心、劑量遞增的研究中，給予28例晚期NAMD的患者玻璃體腔內(nèi)注射AdPEDF.11，觀察發(fā)現(xiàn)注射后的幾個(gè)月，沒(méi)有嚴(yán)重的不良事件及毒副作用，而且其抗血管生成作用可以持續(xù)幾個(gè)月,高劑量載體治療組患者1a后的病變大小穩(wěn)定?？寡苌苫钚约拜d體良好的安全性足夠支持Ⅱ期臨床試驗(yàn)來(lái)測(cè)試載體的有效性。然而，可能由于以下原因，目前并沒(méi)有針對(duì)腺病毒的進(jìn)一步臨床試驗(yàn)：(1)Campochiaro等的研究小組早期進(jìn)行的研究是在幾種小鼠模型中使用編碼人PEDF的腺病毒靶向抑制新生血管的形成[21-22]，在基因治療的發(fā)展史中，被證明與猝死有關(guān)[23]；(2)腺病毒缺乏靶向性，且具有較強(qiáng)的免疫原性，尤其是基因治療持續(xù)時(shí)間短等特點(diǎn)[24]，與基因治療NAMD需要長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)抗VEGF蛋白的設(shè)計(jì)思路背道而馳。隨后Campochiaro等通過(guò)試驗(yàn)使用表達(dá)人PEDF的AAV載體，研究抑制新生血管形成的作用[25]。AAV載體可持續(xù)表達(dá)人PEDF，在小鼠模型中尚未發(fā)現(xiàn)病毒毒性，長(zhǎng)期表達(dá)PEDF對(duì)眼睛的影響需要進(jìn)一步的研究，但利用AAV載體表達(dá)人PEDF在未來(lái)可能是一個(gè)可行的臨床試驗(yàn)。

4.2可溶性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1由Genzyme贊助的Ⅰ期臨床試驗(yàn)(NCT01024998)，是在美國(guó)四家視網(wǎng)膜門診所進(jìn)行的一個(gè)劑量遞增的開(kāi)放標(biāo)簽試驗(yàn)，可溶性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(soluble VEGF receptor 1,sFlt-1)成為研究的靶點(diǎn)。在19例晚期NAMD患眼的玻璃體腔內(nèi)注射編碼sFlt-1的AAV2載體(a recombinant AAV2 encoding sFlt-1，AAV2.sFLT1),隨訪52wk，通過(guò)測(cè)定房水中sFlt-1和AAV2中和抗體(neutralizingantibody，NAbs)的水平，證實(shí)了玻璃腔內(nèi)注射所有劑量下都具有良好的耐受性。然而，在接受最大劑量的患者中，有50%患者沒(méi)有檢測(cè)到sFlt-1。在sFlt-1表達(dá)陽(yáng)性的患者中，4/5患者沒(méi)有測(cè)到NAbs，而另1例患者的滴度非常低(1∶100)。在5例給予最大劑量而無(wú)sFlt-1表達(dá)的患者中，4/5患者的NAbs滴度較高，1例無(wú)NAbs。這項(xiàng)研究結(jié)果表明，需要對(duì)高劑量的AAV2.sFlt-1的安全性和有效性進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)，是否NAbs的存在對(duì)靶基因的表達(dá)有影響，尚須進(jìn)一步的研究[26-27]。

在澳大利亞進(jìn)行了第2個(gè)Ⅰ期、Ⅱa期的單中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)(NCT01494805)，Ⅰ期、Ⅱa期分別招募9例患者和32例患者，符合入選標(biāo)準(zhǔn)條件下所有的患者在治療之初及第4wk接受玻璃體腔內(nèi)注射雷珠單抗的治療，然后每4wk隨訪患者的不良事件及最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA)的變化,必要時(shí)可給予雷珠單抗的補(bǔ)救治療。Ⅰ期臨床試驗(yàn)雖然不足以評(píng)價(jià)載體的療效，但可初步說(shuō)明視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFLT-1(AVA-101)的可重復(fù)性，值得注意的是，4/6接受治療的患者不需要補(bǔ)救治療，2/6患者在隨訪近4mo的治療期間需要1次補(bǔ)救治療[28]。因此該臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的、耐受性良好，而Ⅱa期的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Ⅰ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，但并沒(méi)有新結(jié)果的發(fā)現(xiàn)[29]。隨后，Rakoczy等[30]在前期的臨床研究的基礎(chǔ)上公布了Ⅰ期/Ⅱa期視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFLT-1治療滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性的臨床研究結(jié)果，結(jié)果同之前無(wú)異，同樣由于樣本量少，無(wú)法證實(shí)生物學(xué)效應(yīng)，但它同樣證實(shí)了視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的，同時(shí)在老年人中耐受性良好。

4.3 AA8載體介導(dǎo)的抗人VEGF抗體片段Liu等[31]在表達(dá)人VEGF的轉(zhuǎn)基因小鼠中建立Ⅲ型CNV，通過(guò)視網(wǎng)膜下注射不同劑量的AA8載體介導(dǎo)的抗人VEGF抗體片段(AAV8-antiVEGFfab)，可以觀察到AAV8-antiVEGFfab的抗血管生成及抗血管滲透的作用。研究結(jié)果表明，小鼠眼部注射≥1×107基因拷貝數(shù)(gene copy,GC)的AAV8-antiVEGFfab比無(wú)載體注射可顯著地減少視網(wǎng)膜新生血管(neovascular,NV)的區(qū)域，劑量依賴反應(yīng)可以被觀察到，≤3×107的GC可輕度地減少視網(wǎng)膜新生血管，≥1×108的GC可減少50% NV,3×109或1×1010的GC可幾乎完全消除NV。這項(xiàng)研究強(qiáng)烈地支持在NAMD患者中開(kāi)展視網(wǎng)膜下注射AAV8-antiVEGFfab的臨床試驗(yàn)。

AAV8-antiVEGFfab目前也被Regenxbio公司贊助的Ⅰ期臨床試驗(yàn)(NCT03066258)作為研究目標(biāo)，他們正在評(píng)估AAV8-antiVEGFfab(RGX-314)的安全性和耐受性，RGX-314是一種編碼可溶性抗VEGF蛋白的AAV8載體的藥物。RGX-314旨在對(duì)抗因眼睛中形成的NV而引起視力的喪失，從而減少對(duì)抗VEGF藥物注射頻率的需求。該研究中納入18例晚期NAMD患者，分別接受3種不同劑量的基因治療。從Regenxbio公司公布的Ⅰ期臨床試驗(yàn)的中期數(shù)據(jù)可以看出，基因療法RGX-314在所有劑量下都是安全且耐受良好的，所有三組的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均呈劑量依賴性增高，抗VEGF藥物的注射頻率也呈劑量依賴性減少[27，32]。

4.4內(nèi)皮抑素和血管抑素內(nèi)皮抑素(endostatin)是膠原蛋白18的裂解產(chǎn)物，內(nèi)源性內(nèi)皮抑素在抑制實(shí)驗(yàn)小鼠CNV模型中得到了驗(yàn)證[33]。血管抑素(angiostatin)是纖容酶原的一個(gè)片段，在激光誘導(dǎo)的CNV大鼠模型中，視網(wǎng)膜下注射AAV-Angiostatin可以顯著減小CNV的病變范圍[34]。由Campochiaro等發(fā)布了針對(duì)晚期NAMD患者的Ⅰ期劑量遞增的臨床試驗(yàn)——Endostatin/Angiostatin基因轉(zhuǎn)錄治療黃斑變性的研究結(jié)果(GME研究，NCT01301443)，檢測(cè)表達(dá)Endostatin/Angiostatin的馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)載體的安全性和生物活性。結(jié)果顯示，在該研究的受試對(duì)象中，房水中檢測(cè)到Endostatin/Angiostatin的水平與載體劑量相關(guān)，持續(xù)高水平的Endostatin/Angiostatin在眼內(nèi)表達(dá)可減少FFA中CNV的滲漏，但并不能可靠地消除晚期NAMD患者視網(wǎng)膜下和(或)視網(wǎng)膜內(nèi)液體。每個(gè)劑量組的受試患者的耐受性良好，沒(méi)有劑量限制的毒性，幾乎沒(méi)有眼部炎癥的發(fā)生。與手術(shù)相關(guān)的嚴(yán)重不良事件為黃斑裂孔，在治療過(guò)程中結(jié)局良好。因此視網(wǎng)膜下注射EIAV-Endostatin/Angiostatin(RetinoStat?)是安全的，耐受性良好，可持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，重復(fù)性好[35]。

4.5抗VEGF rAAV-cDNA抗VEGF rAAV-cDNA(ADVM-022/ADVM-O32)是一種編碼阿柏西普(aflibercept)/雷珠單抗(ranibizumab)的優(yōu)化的腺相關(guān)病毒載體的藥物，主要被用于玻璃體腔內(nèi)注射，以傳遞目的基因和高水平表達(dá)治療蛋白。這些療法尚處于臨床前期的研究階段。目前，ADVM-022的臨床前期工作結(jié)束，結(jié)果顯示，在激光誘導(dǎo)的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的CNV模型中，玻璃體腔內(nèi)注射ADVM-022的動(dòng)物模型耐受性良好，可致持續(xù)生成aflibercept，類似于長(zhǎng)期持續(xù)aflibercept作用的效果。此外，在激光照射前13mo給予ADVM-022可預(yù)防臨床相關(guān)的CNV病變的發(fā)生，類似于動(dòng)物CNV模型接受aflibercept的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，單次玻璃體腔內(nèi)注射ADVM-022可能為wet-ARMD提供一種安全有效的長(zhǎng)期治療方案，并可能最終改善患者的視力結(jié)果[36]。ADVM-032仍處于臨床前期的研究階段，尚未公布相關(guān)研究的臨床前試驗(yàn)的數(shù)據(jù)及結(jié)果。

4.6抗TANK結(jié)合激酶1單克隆抗體抗TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)，又稱NF-κB激活激酶(NF-κB-activating kinase,NAK)，是一種廣泛表達(dá)色氨酸、絲氨酸的激酶，它屬于非典型性的IκB激酶，在調(diào)節(jié)I型干擾素(interferon，IFN)的產(chǎn)生和IFN調(diào)節(jié)因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)與NF-κB的信號(hào)通路中起重要的作用[37]。在之前的研究中證實(shí)，TBK1參與多種細(xì)胞途徑的激活和促炎因子的產(chǎn)生，以及細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等功能[38-40]。并且，TBK1可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖，是腫瘤血管形成的新介質(zhì)，同時(shí)它也可以上調(diào)炎性因子的生成發(fā)揮促炎作用，盡管一些研究暗示了TBK1在血管生成和炎癥中的作用，但TBK1在CNV中的作用還未得到驗(yàn)證[41-43]。而在Cui等[37]開(kāi)展的試驗(yàn)研究中證實(shí)，TBK1可以促進(jìn)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞系(A choroid-retinal endothelial cell line,RF/6A)的增殖和成管，增加VEGF的表達(dá)，在激光誘導(dǎo)形成CNV的鼠模型中，玻璃體腔內(nèi)注射抗TBK1單克隆抗體可顯著地減少CNV的形成，這個(gè)研究結(jié)果表明TBK1是治療NAMD的潛在靶點(diǎn)。

5 結(jié)局和展望

基因治療在眼病的治療和失明的預(yù)防方面顯示出巨大的前景。前期的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，基因治療對(duì)視網(wǎng)膜和(或)脈絡(luò)膜CNV的形成、VEGF水平的高表達(dá)有抑制作用，但目前尚不清楚，長(zhǎng)期持續(xù)有效的VEGF阻斷是否會(huì)對(duì)正常脈絡(luò)膜血管和視網(wǎng)膜光感細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。此外，同抗VEGF中和蛋白的治療相似，抗VEGF基因治療效果的喪失是對(duì)NAMD的另一個(gè)重要的臨床問(wèn)題。盡管基因療法在治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性中展現(xiàn)出積極的效果，但仍需要大量臨床前期的研究結(jié)果來(lái)驗(yàn)證這些問(wèn)題，同時(shí)可為后期臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。